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猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起、以呕吐、脱水、腹泻为主要临床症状的猪肠道传染病。本研究测定了两株PEDV全基因组序列,并对截短S蛋白进行表达。具体研究内容如下:1.PEDV全基因组序列分析根据PEDV经典株CV777全基因组序列,设计25对相互重叠的引物,以扩增PEDV全长。RT-PCR扩增、纯化后连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态中,挑选阳性克隆进行测序,确定各片段序列后拼接为全基因组并进行分析。结果表明,JSLS-1、JS-2全基因组全长分别为27861nt、27930nt(GenBank登录号为KX534205、KX534206),基因组排列与PEDV经典毒株CV777一样,为5’-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’。将JSLS-1、JS-2株及其他30株已测得全基因组的PEDV毒株进行比较,并使用MEGA7.0软件绘制系统发育树。结果显示,32株PEDV可分为两个大群即I群与II群;I群主要由2010年以后报道的毒株(包括美国流行株);II群主要由经典毒株组成,JSLS-1、JS-2属于II群。本研究分析比较了JSLS-1、JS-2株5‘UTR、3‘UTR区域、ORF1a、及结构蛋白S、E、M、N及非结构蛋白ORF3的遗传进化特征。与经典毒株CV777相比,JSLS-1 5’UTR发生碱基插入、缺失、突变,3‘UTR发生碱基插入、突变,ORF1a、S、E、ORF3发生碱基缺失、突变,M、N基因仅发生突变,未出现插入或缺失;JS-2株基因突变、缺失、插入情况同JSLS-1。2.PEDV部分S蛋白原核表达及高免血清制备使用生物信息学软件及在线分析网站分析PEDV JS-2株S蛋白序列,选取抗原表位集中的两个区域;同时选取PEDV S基因抗原表位区域(COE),设计带有酶切位点的引物,RT-PCR扩增出三个基因片段,将扩增出的片段克隆至pMD18-T载体上,通过测序分析正是该片段与JS-2的S基因序列一致;然后将克隆化截短S1基因亚克隆到表达载体pET32a(+),获得了重组表达质粒。将重组表达质粒转化到宿主菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导后,成功表达三个截短蛋白,蛋白大小与预期一致。经表达形式鉴定,目的蛋白以包涵体形式存在。使用割胶纯化的方法获得高纯度重组蛋白。将蛋白与赛彼科206佐剂乳化后免疫5周龄昆明小白鼠雌鼠,十天后二免,二免十天后三免,三免十四天后采集血液、制备血清、处死小鼠。使用PEDV全病毒作为包被抗原,将所有血清进行200倍稀释后检测其中的抗体效价,ELISA检测结果表明:免疫后抗体水平明显上升,三免十四天OD450约为1,表现出较高的抗体水平。证明所选的三个S蛋白区域具有一定的抗原性。