论文部分内容阅读
背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是临床常见疾病之一,是引发心脑血管疾病的重要病因,其引起的相关疾病冠心病、脑卒中、外周血管病等严重危害人类健康,在我国这一问题日益严峻。随着社会的高速发展,尤其是社会人口老龄化进程的加速,导致心血管疾病的患者数增加。中药在AS的防治方面有独特的优势。夏枯草作为软坚散结药物,是临床中治疗AS的常用中药之一,但药理作用及机制有待深入研究。目的:预测夏枯草药物可干预AS病程的活性成分和作用通路,并通过体外建立细胞缺氧模型和泡沫细胞模型,研究夏枯草活性成分对细胞缺氧和脂质代谢紊乱的治疗效果,进而研究其作用机制。方法:一、基于网络药理学探讨夏枯草活性成分治疗AS的作用靶点及相关通路使用网络检索平台TCMSP和文献检索确定夏枯草的有效活性成分与作用靶点信息,利用OMIM数据库和HPO数据库汇总AS疾病靶点。使用STRING数据库和Cytoscape 3.7.1的Network Analyzer插件绘制靶点蛋白互作网络(PPI),借助Clue GO插件、DAVID在线分析平台进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析。探讨夏枯草活性成分的多重药理作用机制,及AS的发病机制。为下一步实验验证奠定基础。并使用分子对接方法模拟验证夏枯草活性成分与关键靶点的对接结果,虚拟筛选出与活性成分稳定对接的关键靶点。二、夏枯草活性成分干预细胞缺氧模型的研究培养293T细胞,利用293T细胞建立细胞缺氧模型对夏枯草活性成分做体外活性实验,将通过网络药理学分析得到的夏枯草四种活性成分分别配置成0.1-100μM浓度梯度,通过CCK-8和LDH检测,明确各个活性成分对293T细胞的无毒浓度;通过细胞转染实验,构建p GL-HIF-1α真核表达质粒,建立体外细胞缺氧模型,再将已筛选的夏枯草活性成分按照合适浓度梯度干预细胞模型,通过双荧光报告基因检测,明确是否对HIF-1α的表达有抑制作用,最后使用Western blot方法检测HIF-1α蛋白表达情况。三、体外泡沫细胞模型建立和夏枯草活性成分对脂质滴形成的抑制作用研究使用RAW264.7巨噬细胞和氧化低密度脂蛋白OX-LDL建立体外泡沫细胞模型,分别给予0.01-10μM夏枯草活性成分24h后,应用优化后的油红O染色方法,观察夏枯草四种活性成分对泡沫细胞脂质滴生成的抑制作用。四、夏枯草活性成分调节脂质代谢紊乱机制研究使用RAW264.7巨噬细胞和OX-LDL,建立体外泡沫细胞模型。分别给予0.01-10μM夏枯草活性成分24h后,检测泡沫细胞中总胆固醇的含量,并通过western blot方法检测胆固醇转运相关蛋白的表达情况,最后使用HIF-1α蛋白抑制剂检测对泡沫细胞中脂质滴的影响。结果:一、基于网络药理学探讨夏枯草治疗AS的作用靶点及相关通路通过网络药理学分析和相关文献检索确定夏枯草含有槲皮素、木樨草素等14个活性成分,对应EGFR、EGF、IL-6、VEGFA、MMP9等靶点,涉及包括AGE/RAGE、TNF、HIF-1等信号通路。“活性成分-靶点”网络揭示了夏枯草多个活性成分和多个靶之间的密切相互作用,通过夏枯草作用靶点PPI网络分析可知夏枯草作用靶点中的关键靶点,KEGG通路富集分析和GO功能富集分析明确夏枯草活性成分涉及的生物通路和基因功能;AS疾病相关靶点的PPI网络分析可知AS疾病关键靶点。对AS关键靶点进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析明确AS病程相关的生物通路信息与基因功能;此外,筛选夏枯草及疾病靶点重叠部分,对此部分进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析,初步探索夏枯草对AS起治疗作用的生物通路与基因功能。通过网络药理学筛选分析可知,木樨草素、咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇四个活性成分与AS疾病的相关性最高。使用分子对接技术虚拟验证四个活性成分与重叠靶点的稳定连接。二、夏枯草活性成分干预细胞缺氧模型的研究与Contorl组相比,木犀草素100μM浓度对细胞增殖有明显抑制作用,10μM、1μM和0.1μM浓度无明显抑制;并且在100μM浓度下对细胞LDH释放有明显促进作用,10μM、1μM和0.1μM浓度无明显促进;咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇的浓度均相同为100μM浓度对细胞增殖有明显抑制效果,10μM、1μM和0.1μM浓度无明显抑制;并且在100μM浓度下对细胞LDH释放有明显促进作用,10μM、1μM和0.1μM浓度无明显促进;在转染实验中,通过双荧光报告基因检测可知3×浓度的转染液环境下转染效率最高;将四种夏枯草活性成分10μM的浓度,给予细胞进行干预后,对于HRE的转染效果均有抑制作用,并通过Western blot蛋白印迹法,检测夏枯草活性成分对模型细胞中HIF-1α蛋白的表达调控情况。结果显示夏枯草四种活性成分,对于模型细胞中的HIF-1α蛋白的表达均有抑制作用。三、小鼠泡沫细胞模型建立和夏枯草活性成分对脂质滴形成的抑制作用研究通过实验证明使用120μg/ml浓度的OX-LDL建立的泡沫细胞模型最为稳定。在细胞毒性实验中发现,与Contorl组相比,夏枯草的四种活性成分中木犀草素100μM浓度对细胞活力有明显抑制效果,0.1-10μM浓度无明显抑制;并且在100μM浓度下对细胞LDH释放有明显促进作用,0.1-10μM浓度无明显影响;咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇的浓度均相同为100μM浓度对细胞活力有明显抑制效果,0.1-10μM浓度无明显抑制;并且在100μM浓度下对细胞LDH释放有明显促进作用,0.1-10μM浓度无明显影响。在抑制泡沫细胞内脂质滴形成实验中,10μM浓度的夏枯草活性成分对脂质滴的抑制作用最明显。四、夏枯草活性成分调节脂质代谢紊乱机制研究检测夏枯草活性成分对泡沫细胞模型中胆固醇含量的影响。与Control组相比,模型组细胞内胆固醇沉积含量均有明显上升,分别用阳性药和夏枯草活性成分木樨草素、咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇对其进行干预治疗,由结果可知阳性药可以明显降低泡沫细胞明显中胆固醇的沉积含量,夏枯草活性成分对胆固醇的沉积抑制作用与使用浓度呈相关性,10μM浓度的活性成分具有明显的抑制作用。随着浓度的逐级减低,抑制效果也逐渐降低。可知夏枯草活性成分可以降低泡沫细胞内脂质的沉积,有利于降低巨噬细胞泡沫化的程度。在调控胆固醇转运蛋白方面,10μM的木樨草素、咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇对泡沫细胞中胆固醇转运相关蛋白HIF-1α、PPAR-γ、LXR-α、ABCA1和ABCG1的分泌具有明显的调节作用。最后加入HIF-1α蛋白抑制剂检测对泡沫细胞中脂质滴的影响,明确夏枯草活性成分是否通过HIF-1途径影响泡沫细胞的生成。结论:(1)夏枯草活性成分可能通过HIF-1通路对AS产生治疗作用(2)夏枯草活性成分木樨草素、咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇可以抑制缺氧细胞中HIF-1α蛋白含量。(3)夏枯草活性成分木樨草素、咖啡酸、槲皮素和β-谷甾醇可以抑制泡沫细胞模型中脂质的沉积并且对胆固醇转运蛋白的表达有调节作用。