【摘 要】
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表观基因组是一系列与DNA和蛋白有关的化学修饰,它们可在不改变DNA序列的情况下对基因表达进行调控,并在发育和疾病发生过程中发挥重要作用。当前的技术已经允许研究人员对实验样品进行常规的表观基因组表征,然而我们对表观遗传元件功能的理解到目前为止仍显不足。基于CRISPR基因编辑技术的筛选文库对阐明全基因组范围内的表观遗传元件的生物学功能具有重要意义,但是CRISPR筛选需要构建庞大的sgRNA文库,
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表观基因组是一系列与DNA和蛋白有关的化学修饰,它们可在不改变DNA序列的情况下对基因表达进行调控,并在发育和疾病发生过程中发挥重要作用。当前的技术已经允许研究人员对实验样品进行常规的表观基因组表征,然而我们对表观遗传元件功能的理解到目前为止仍显不足。基于CRISPR基因编辑技术的筛选文库对阐明全基因组范围内的表观遗传元件的生物学功能具有重要意义,但是CRISPR筛选需要构建庞大的sgRNA文库,其商业合成成本高,极大的限制了该技术的广泛应用。在本研究中,我们开发了一种新型、高通量、简单且低成本的基于DNA模板可控延伸（CTDE）原理快速转换合成sgRNA文库的方法。基于CTDE方法合成的sgRNA文库可以覆盖模板DNA中98.47%的有效CRISPR/Cas9靶向位点,并且超过99%的sgRNAs靶向位点紧邻一个PAM序列。基于本研究开发的CTDE方法,我们取得了以下几项突破。首先我们以鼠胚胎干细胞（mESCs）中H3K4me3和CTCF蛋白结合的DNA,和人肝癌细胞系（HepG2）中H3K4me3蛋白结合DNA为模板,合成了含有2,800,000个sgRNAs的筛选文库。然后通过CRISPR筛选和基于CFD得分的过滤,我们成功鉴定了影响mESCs和HepG2细胞增殖的12,887个H3K4me3和2,206个CTCF的必需的表观遗传学元件,实现了首次对哺乳动物细胞中H3K4me3和CTCF元件的功能性表观基因组注释。而且mESCs CTCF元件的筛选结果显示mESCs保留了大部分的非必需的细胞特异的CTCF元件,说明这些元件可能对于干细胞的多能性的维持很重要。通过表征HepG2细胞中重要的H3K4me3元件,揭示了功能性表观基因组注释在癌症研究中的重要性。
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