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目的:利用噬菌体展示技术筛选针对硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅰ(PeroxiredoxinⅠ,PrxⅠ)抗原的肺腺癌特异性抗体(抗PrxⅠ抗体)并检测其性能,放射性核素标记抗PrxⅠ抗体后行荷瘤裸鼠体内分布及抑制肺腺癌生长作用研究。
方法与结果:
第一部分噬菌体抗体库的固相消减性筛选
1.负性筛选:以正常支气管上皮HBE16细胞对抗体库负性筛选,除去抗体库中非肺腺癌细胞特异性抗体。
2.全细胞筛选:以全肺腺癌A549细胞对经正常支气管上皮HBE16细胞负性筛选后的抗体库进行3轮筛选富集,得到肺腺癌A549细胞特异性的抗体。分别在每轮筛选富集前后测抗体滴度,结果显示收获率逐渐升高。
3.已知抗原筛选:以PrxⅠ抗原对经肺腺癌A549细胞筛选后的抗体库进行3轮筛选,以获得PrxⅠ特异性抗体(抗PrxⅠ抗体)。分别在每轮筛选富集前后测抗体滴度,结果显示收获率逐渐升高。
4.可溶性抗体的表达:制备单克隆抗体,ELISA检测证实为阳性噬菌体克隆转染大肠杆菌Ecob HB2151,IPTG诱导培养后纯化,得到纯化的抗PrxⅠ抗体。
5.抗PrxⅠ抗体的鉴定:抗PrxⅠ抗体行SDS-PAGE检测,电泳分离得到30ku蛋白条带,此蛋白即为经大肠杆菌E.coli HB2151可溶性表达得到的抗体蛋白;抗PrxⅠ抗体经细胞ELISA及免疫细胞化学法检测,显示抗体具有较高的特异性,能与肺腺癌A549细胞特异性结合。
第二部分抗PrxⅠ抗体体外作用研究
1.抗PrxⅠ抗体内摄量测定:放射性核素131Ⅰ经氯胺T法标记抗PrxⅠ抗体并纯化,37℃条件下,标记后的抗体(131Ⅰ-PrxⅠ抗体)作用于肺腺癌A549细胞。作用后洗涤细胞,再溶解细胞,分别收集洗脱液及溶胞液,测洗脱液及溶胞液的放射性计数。与4℃孵育条件的对照组相比,37℃条件下,抗。PrxⅠ抗体能有效结合并进入肺腺癌A549细胞内。
2.抗PrxⅠ抗体体外作用:抗PrxⅠ抗体与肺腺癌A549细胞作用72小时后分别检测细胞增殖及凋亡情况,与对照组相比,MTT检测发现抗PrxⅠ抗体组有抑制细胞增殖作用;流式细胞检测发现,抗PrxⅠ抗体组细胞凋亡率较高。证实抗PrxⅠ抗体有抑制肺腺癌A549细胞增殖,促进凋亡作用。
3.PrxⅠ蛋白表达测定:抗PrxⅠ抗体作用A549细胞72小时后,提总蛋白,Western blot检测显示,与对照组相比,抗PrxⅠ抗体组PrxⅠ蛋白表达水平较低。证实抗PrxⅠ抗体作用细胞后PrxⅠ蛋白表达受到抑制。
第三部分抗PrxⅠ抗体在荷肺腺癌裸鼠模型体内分布及抑瘤作用
1.131Ⅰ-PrxⅠ抗体稳定性检测:131Ⅰ-PrxⅠ抗体经层析柱纯化,三氯乙酸沉淀法测抗体的放射性核素标记率、放射化学纯度及比活度,结果显示标记抗体达到放免显像治疗要求。37℃条件下,131Ⅰ-PrxⅠ抗体与人血清孵育48小时,放射化学纯度与孵育1小时的比较无明显降低。证明131Ⅰ-PrxⅠ抗体稳定性较好。
2.抗PrxⅠ抗体体内分布研究:建立荷人肺腺癌裸鼠模型,肿瘤长至要求大小后进行实验。131Ⅰ-PrxⅠ抗体经尾静脉注射,不同时间处死裸鼠,测肿瘤及组织每克组织百分注射剂量率(％ID/g),同样裸鼠模型不同时间行单光子发射计算机断层成像术(SPECT)显像。结果示:131Ⅰ-PrxⅠ抗体注射后,测瘤/血、瘤/肌肉放射性计数比值逐渐升高,即肿瘤组织对抗体的摄取随时间增加而逐渐增多,在第48小时时达到峰值(瘤/血、瘤/肌肉比分别为4.06±0.13、5.17±0.97)。SPECT显像肿瘤显示最清晰出现在第48小时。
3.抗PrxⅠ抗体体内抑瘤作用研究:荷肺腺癌裸鼠随机分成3组,实验组经尾静脉注射131Ⅰ-PrxⅠ抗体,对照组注射生理盐水、131Ⅰ-IgG,1次/2天,共14次,4周后处死经各组治疗后的荷瘤裸鼠,剥离肿瘤组织,计算抑瘤率。剥离肿瘤组织病理切片,显微镜下观察病理学改变。结果显示,131Ⅰ-PrxⅠ抗体组肿瘤质量及体积较其他2组均有明显减低,抑瘤率56.8%。病理切片HE染色后镜下观察131Ⅰ-PrxⅠ抗体组可见大片肿瘤细胞坏死,核碎裂、核溶解明显。
结论:本研究利用噬菌体展示技术从己构建的噬菌体抗体库中筛选抗PrxⅠ抗体,通过抗体的可溶性表达,性能检测,放射性核素标记后,应用于体内外抑制肺腺癌A549细胞增殖的研究。研究结果表明成功筛选出抗PrxⅠ抗体,该抗体能与肺腺癌A549细胞特异性结合,有效抑制体外肺腺癌A549细胞增殖。131Ⅰ-PrxⅠ抗体荷瘤裸鼠体内研究显示,131Ⅰ-PrxⅠ抗体特异性及靶向性较好,得到了满意的体内分布及抑制肿瘤生长的结果,为肿瘤的诊断及靶向治疗提供思路。