研究背景和目的：不育不孕症是影响人类繁衍和心理健康的一种重要临床疾病,其中约有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一,由睾丸生成,它逐渐成熟后贮存在附睾内,但此时的精子是不具有授精能力。精子进入雌性生殖道后,随着理化环境(pH值、渗透压和化学成份等)的改变,会经历获能、超活化和顶体反应等生理过程,最终完成授精。这些生理过程是精子功能必不可少的部分,对精子完成授精至关重要。与在其它细胞相似,Ca2+作为精子细胞的第二信使扮演着重要的角色,其直接或者间接调控精子获能、超活化和顶体反应等重要生理过程。Ca2+通过精子细胞膜上的Ca2+通道流入细胞中。目前利用电生理技术在小鼠精子上检测到电流只有两种,一是由CatSper通道介导的Ca2+电流；另一是由Slo3通道介导的K+电流。已经有研究表明小鼠精子上最主要的K+离子通道——Slo3在精子的获能过程中具有重要作用。随着精子胞内碱化,精子膜上的pH依赖的Slo3通道随之开放,导致细胞膜电位超极化。膜电位超极化可能通过两方面影响精子ca2+信号：一方面增加Ca2+内流的驱动力使Ca2+内流增多；另一方面降低电压依赖的CatSper通道开放概率而减少Ca2+内流。尽管推断Slo3通道是精子Ca2+信号的重要调节,但其单独对的Ca2+信号作用尚不明确。在诸多的Slol通道特异的以及广泛的K+通道阻断剂中,如CTX、IbTX、TEA、4-AP以及奎尼丁等,只有奎尼丁能强效抑制Slo3通道。另外活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)对小鼠精子功能也具有影响作用。虽然适量的ROS与精子正常生理功能密切相关,但是ROS过量时会引起细胞氧化-抗氧化失衡,对精子造成严重的损伤,降低精子活性、抑制顶体反应、严重影响精子的授精能力。ROS对精子造成的损伤与Slo3-/-精子的表型非常相似,另外已知ROS对Slo1通道有抑制作用,而Slo3与Slol在结构上非常相似,基于这些相似性我们推断ROS可能通过作用于Slo3通道而对精子胞内Ca2+信号有影响作用。通过本课题的研究希望探索到男性不育与Slo3通道的相关病因,以及为开发新型、安全、有效的男性避孕药提供理论依据。方法：一、利用荧光共聚焦Ca2+成像技术,对三个月以上的雄鼠精子处理后进行实验；对细胞进行以下处理：空白对照组(Ctrl)、奎尼丁处理组(Ctrl+Qui)、过氧化氢(H202)处理组,随机选取三个月以上的雄性小鼠。实验内容：1、取小鼠附睾尾部分装在离心管中离心；2、将离心后的精子分置在已经涂有Cell-Tak和Poly-L-lysine hydrobromide等试剂的容器中,并使细胞充分贴壁；3、在精子充分贴壁的容器中加入Fluo-4AM染料,在保证室温、避光等实验条件下使细胞染色30分钟；4、将黏贴有精子的容器充分清洗后,在60倍油镜下观察精子给药后的荧光变化,激发光波长488nm,接收波长535-565nm。二、利用膜片钳技术：在全细胞模式下充分研究奎尼丁对KSper的抑制,预期找到奎尼丁阻断精子本身K+电流的剂量-效应关系。结果：1、奎尼丁会使精子细胞Ca2+信号降低,并且这种降低作用与奎尼丁浓度呈正相关,即随着奎尼丁浓度的增加,其对精子Ca2+信号的抑制作用也增加。奎尼丁实验浓度分别为0.1μM、1pM,10μM、100μM和1000μM,加药后观察到精子细胞Ca2+信号都下降,0.1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号降低约16%；1μM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca2+信号发生大约28%的下降；10μM浓度的奎尼丁就可以引起精子内Ca2+信号发生更大的变化,大约降低45%；而100μM及1000μM浓度的奎尼丁引起精子细胞Ca2+信号降低的幅度更大,分别约73%和90%。信号下降一般的药物浓度(IC50)大约是11μM。有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大约是10μM。2、我们初步的数据表明H202也影响精子Ca2+信号。但与奎尼丁不同的是,过氧化氢在低浓度时表现出对精子Ca2+信号的促进作用；在高浓度时则表现出较大的抑制作用。过氧化氢实验浓度分别为100μM、1000μM、1×106μM,100μM浓度的H202使精子细胞Ca2+信号增加约30%,而1000μM和1×106μM浓度的H202则使精子细胞Ca2+信号分别下降60%和90%左右。H202对精子Ca2+信号的影响是否与Slo3通道相关还需要更深入的研究。结论：当Slo3通道被奎尼丁抑制时精子细胞内Ca2+浓度降低,提示受碱性激活Slo3通道开放时其净作用将增加细胞Ca2+的内流。