研究背景肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上癌症相关的主要死亡原因之一,近年来在我国癌症发生率及死亡率中稳居前列。虽然目前的治疗方式主要为手术、化疗、靶向和肝动脉化疗栓塞术等,但预后仍然较差,晚期或复发的肝癌患者更是缺少有效的治疗方法。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞（CAR-T）疗法是一种新的免疫治疗方法,在复发或者难治性B细胞恶性肿瘤治疗方面都有着很好的效果并在临床广泛运用;靶向GPC3的CAR-T细胞治疗肝癌的临床试验也在开展中,然而治疗效果有限。CAR-T细胞疗法用于治疗实体肿瘤仍是一个挑战,比如肿瘤血管屏障、肿瘤免疫抑制微环境等因素都限制了CAR-T细胞疗法在实体瘤（包括肝癌）的应用,因此克服肿瘤微环境的抑制作用、提高CAR-T细胞疗法在实体瘤上的疗效尤为重要。已有研究证明,低氧、酸性、低营养的肿瘤微环境会引起T细胞的代谢障碍,导致T细胞中的NAD+水平下降,从而影响T细胞的激活及抗肿瘤功能。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是糖酵解、三羧酸循环等重要的细胞代谢途径中的重要分子,是细胞能量代谢中的重要介质。NAD+通过从头合成、Preiss-Handler途径以及挽救途径这三条路径进行生物合成。其中烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是NAD+挽救途径中的关键酶,利用NAMPT的抑制剂FK866可以显著降低细胞中NAD+的水平。烟酰胺核苷（NR）,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体底物之一,摄入之后可以安全有效地增加人体内NAD+的水平。通过NAD+的前体烟酰胺（NAM）来补充NAD+可增强靶向CD19的CAR-T细胞对血液肿瘤的杀伤能力,但针对通过NR补充NAD+是否能增强CAR-T细胞对实体瘤的杀伤能力尚未见文献报道。因此,本研究旨在构建靶向GPC3的CAR-T细胞,体外模拟肿瘤微环境中T细胞低NAD+表达状态,检测补充NR对T细胞的影响,并通过小鼠体内实验检测口服NR对靶向GPC3的CAR-T细胞对肝癌的杀伤作用的影响。材料和方法1.体外用不同浓度的FK866处理T细胞后,经流式细胞术检测T细胞凋亡情况。通过NAMPT抑制剂FK866和/或NR处理T细胞后,通过液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术检测T细胞内的NAD+水平。2.用流式细胞术和Western blot方法检测肝癌细胞系SK-HEP-1、Hep G2和Huh7中GPC3的表达情况。3.从健康者外周血中分离T细胞,用慢病毒感染构建靶向GPC3的含CD28、4-1BB共刺激域的第三代CAR-T细胞,流式细胞术和Western blot方法检测感染效果。4.体外用FK866和/或NR预处理GPC3-CAR T细胞后,检测GPC3-CAR T细胞对Hep G2和Huh7细胞株的杀伤效果。5.通过使用NSG小鼠,构建Huh7皮下瘤和Huh7 GL腹腔转移瘤模型,探究NR对GPC3-CAR T细胞对肝癌皮下瘤及腹腔转移瘤治疗效果的影响。结果1.NAMPT抑制剂FK866可以降低T细胞的NAD+,但不会影响T细胞的活力,能够用于体外模拟肿瘤微环境中T细胞的低NAD+状态;同时补充NR可以逆转FK866对T细胞NAD+的抑制,提高T细胞内的NAD+水平。2.流式检测GPC3在肝癌细胞系Hep G2和Huh7中呈高表达,而在SK-HEP-1细胞中呈阴性表达。3.流式细胞术和Western blot结果验证了第三代GPC3-CAR T构建成功,阳性率为36.4%。4.体外细胞实验结果表明补充NAD+可以逆转FK866对GPC3-CAR T杀伤作用的抑制,提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。5.体内动物实验结果表明补充NAD+前体NR可以提高CAR-T细胞对肿瘤的杀伤能力,延长小鼠的生存时间。结论NAD+前体NR可以逆转FK866对T细胞NAD+的抑制,提高T细胞内的NAD+水平;补充NR可以增强靶向GPC3的CAR-T细胞的抗肝癌效果。