ZAP抗HIV活性及ZAP磷酸化修饰的研究

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锌指结构抗病毒蛋白ZAP是一种含有四个-CCCH锌指结构的宿主细胞抗病毒因子,它是通过特异的抑制细胞质内病毒RNA积累来抑制鼠白血病病毒(MLV)和辛德比斯病毒(SIN)的复制。   本文首次发现了人ZAP(hZAP)和大鼠ZAP(rZAP)都可以显著地抑制HIV-1、MLV和SIN的复制。hZAP的这种抗病毒功能也需要完整的外切酶体复合物(exosome)的存在。运用免疫共沉降实验方法,作者发现hZAP同exosome组分之间存在不依赖于RNA的直接相互作用。通过GST Pull-down实验,进一步证实了hZAP同hRrp42p之间发生了直接相互作用。通过shRNA降低hRrp42p的表达水平后,hZAP的抗病毒活性明显降低。而回复hRrp42p表达水平后hZAP的活性也随之回复。随后通过截短体蛋白的GST Pull-down实验,确定出hZAP同hRrp42p相互作用的区域。   作者还发现hZAP也是CRM1依赖的核质穿梭蛋白,含有至少两个核输出序列(Nuclear Express Sequence,NES)和两个核定位序列(Nuclear LocatedScquence,NLS)。构建一系列hZAP截短体和定点突变体,通过免疫染色实验,考察这些蛋白的细胞内定位,结果发现hZAP除了L290、V293这一NES外,在454-492氨基酸残基区域附近还存在着NES。而两个NLS所在区域锁定在N-端1-300与C-端492-902氨基酸残基区域内。   在本文中,作者还发现在rZAP的N-端255-290氨基酸残基区域内的八个丝氨酸上存在着磷酸化修饰,确定了274位、283位两个磷酸化位点。这种磷酸化修饰可以使rZAP的抗病毒功能增强,激酶GSK3β是这一蛋白修饰的执行者之一。GSK3p的表达水平会影响rZAP的抗病毒功能。采用定点突变技术构建系列rZAP N-端突变体,通过考察他们在Westem Blot中条带迁移率的变化确定修饰位点,通过碱性磷酸酶反应确定其修饰形式为磷酸化。将丝氨酸突变为甘氨酸从而突变掉磷酸化位点会使rZAP的功能显著降低,说明这种磷酸化修饰是宿主细胞对于rZAP功能的调节手段之一。体外磷酸化实验证实GSK3p是执行这一磷酸化修饰的激酶之一,RNAi敲低或过表达GSK3β可以影响rZAP的抗病毒功能。
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