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本文通过核磁共振弛豫方法研究了枯草芽孢杆菌中还原态和氧化态ArsC的动力学特性,及其与硫氧还蛋白(TrxA)的复合物在毫秒时间尺度的动力学行为,因而首次从动力学角度对ArsC作用的分子机理有了更深层次的认识。研究主要分为两个部分:
1.利用核磁共振方法研究枯草芽孢杆菌中还原态和氧化态砷酸还原酶的主链动力学。我们测量了25℃下还原态和氧化态ArsC的主链15N原子的纵向弛豫速率R1,横向弛豫速率R2和异核稳态{1H}-15NNOE数据,并应用Model-free方法对弛豫参数进行分析,得到两种状态下ArsC的整体运动信息以及在皮秒到纳秒时间尺度和微秒到毫秒时间尺度的内部运动信息。还原态和氧化态ArsC在水溶液中具有相似的整体运动特性,都可以用相似的轴对称旋转扩散模型来描述。通过对整体运动相关时间τm的分析,我们得知两种状态ArsC在水溶液中都以单体的形式存在。通过对内部运动参数(S2,τe,Rex)的分析,我们发现虽然还原态和氧化态ArsC的整体运动相似,但在局部区域却具有明显不同的内部运动特性。还原态ArsC中活性位点P-loop以及Cys82-Lys97区域存在着显著的毫秒时间尺度的构象交换。P-loop区域的构象交换促进酶和底物的结合,这是酶催化反应所必需的。而Cys82-Lys97的构象交换可以使Cys89克服空间上的距离与Cys82形成二硫键,完成催化反应循环。在氧化态ArsC中Cys82-Lys97区域存在的皮秒到纳秒时间尺度的快速运动以及可能的毫秒时间尺度的运动,可以促进氧化态ArsC与TrxA的相互作用,并最终将ArsC从氧化态还原成有活性的还原态。
2.砷酸还原酶与硫氧还蛋白复合物的动力学研究。我们应用TROSY-CPMG差量技术研究了25℃下ArsC与TrxA复合物中ArsC毫秒时间尺度构象交换运动特性。结果表明:复合物中的ArsC具有构象交换的区域与还原态ArsC完全一致。对比二硫键的形成和断开与P-loop区域和82至97区域运动特性的关系,我们推论Cys82-Cys89之间二硫键的形成可能是影响这一区域动力学性质的重要因素。氧化态ArsC与TrxA结合形成ArsC-TrxA复合物中间体时,Cys82-Cys89二硫键断裂,ArsC的动力学特性就因二硫键的断裂发生改变,动力学特性的这种转变可以使TrxA更容易离开复合物中间体,从而推动ArsC向还原态转变。