背景：咪唑啉受体(Imidazoline receptors)广泛分布于人体,目前发现的咪唑啉受体有三个亚型Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅰ3。其中Ⅰ2受体主要分布于大脑的最后区、弓状核、脚间区、松果体和室管膜等。Ⅰ2受体已被证实具有镇痛、抗抑郁和神经保护等作用,因此被认为是治疗部分神经系统疾病的潜在靶点。体外配体结合实验已发现了一些高选择性的Ⅰ2受体配体,而目前在体内水平系统全面的比较和探讨Ⅰ2受体配体的药理学作用机制的研究还未见报道,因此本课题第一部分采用药物辨别实验研究Ⅰ2受体配体的大鼠辨别刺激效应(特定剂量的某种药物控制着动物的操作行为),比较不同Ⅰ2受体配体的异同点,探讨Ⅰ2受体的药理学机制,为更好地研究Ⅰ2受体药理学功能奠定基础。Ⅰ2受体配体CR4056具有一定的镇痛效应,但是Ⅰ2受体其它配体是否能减弱炎性疼痛和神经性疼痛,目前尚无研究报道,因此在本课题第二部分第一章我们首次验证并比较不同Ⅰ2受体配体在炎性疼痛和神经性疼痛模型中的镇痛效应,研究发现反复使用Ⅰ2受体配体并不产生耐受和交叉耐受效应,而且Ⅰ2受体配体可明显减弱大鼠的情绪性疼痛,这些研究结果表明Ⅰ2受体配体具有很好的临床应用前景。为了比较Ⅰ2受体配体与其他常用镇痛药的药理学作用的异同,在本课题第二部分第二章我们采用研究冲动行为的延迟折扣模型比较了三种具有镇痛效应且来自不同神经递质系统的药物,I2受体配体cR4056、阿片类镇痛药吗啡(Morphine)和肾上腺素α2受体激动剂镇痛药可乐定(Clonidine)。Ⅰ2受体的分子结构以及下游信号通路目前尚不清楚。由于Ⅰ2受体可能与μ阿片受体具有一定的重合效应,研究发现PKCε/ERK通路在Morphine的镇痛效应中发挥重要的调控作用,因此在本课题的第三部分运用分子生物学实验方法探讨PKCε/ERK通路是否参与介导Ⅰ2受体产生镇痛效应的分子机制。目的：(1)研究Ⅰ2受体配体的辨别刺激效应,比较不同I2受体配体的异同点,探讨Ⅰ2受体的药理学机制。(2)研究Ⅰ2受体配体在炎性疼痛和神经性疼痛模型中的镇痛效应,探讨反复使用Ⅰ2受体配体是否可以产生耐受和交叉耐受效应。(3)比较Ⅰ2受体配体CR4056与其他药理学机制的镇痛药对大鼠冲动行为的影响是否有差异。(4)首次探讨Ⅰ2受体配体产生镇痛效应的分子机制。方法：(1)药物辨别实验：每组8只SD(Sprague-Dawley)大鼠,共5组(2-BFI、CR4056、 BU224、Phenyzoline和Tracizoline组)。在以食物颗粒为奖赏的两杆操作箱中,训练大鼠分别辨别5.6mg/kg的2-BFI和生理盐水、10mg/kg的CR4056和生理盐水、5.6mg/k的BU224和生理盐水、32mg/kg的Phenyzoline和生理盐水,10mg/kg的Tracizoline和生理盐水。在分别能辨别出2-BFI、CR4056、BU224、 Phenyzoline和Tracizoline的各组大鼠中,进行Ⅰ2受体配体(2-BFI、CR4056、 BU224、Phenyzoline、Tracizoline、Idazoxan和RS45041)的相互替代测试、其它神经递质系统配体(μ阿片受体激动剂Morphine和Methadone、NMDA受体拮抗剂Ketamine、单胺氧化酶抑制剂Harmane、α2受体激动剂Clonidine和多巴胺受体间接激动剂Methamphetamine)的替代测试、训练药物(2-BFI、CR4056、BU224和Phenyzoline)与Ⅰ2受体其它配体的组合测试以和训练药物与其它神经递质系统拮抗剂(a2受体拮抗剂Yohimbine、μ阿片受体拮抗剂Naltrexone、多巴胺D2受体拮抗剂Haloperidol和5-HT2A受体拮抗剂MDL100907)的组合测试。根据替代测试结果(完全替代、部分替代或者不能替代训练药物的辨别刺激效应)以及组合测试结果(增强、减弱或者不影响训练药物的辨别刺激效应)比较不同配体的异同,研究Ⅰ2受体的体内受体药理学机制。(2)疼痛模型的建立和疼痛测量的方法：大鼠接受坐骨神经慢性压迫性损伤手术(chronic constriction injury)或脚掌被注射0.1ml的弗氏完全佐剂(Complete Freund’s adjuvant, CFA),建立神经性疼痛和炎性疼痛模型；在两种疼痛模型中,分别急性和慢性注射不同的Ⅰ2受体配体,运用范式弗莱毛方法(von Frey filiament)测试大鼠的机械性疼痛阈值(pain withdrawal threshold, PWT),运用发热光源刺激大鼠的足底,测试大鼠的热刺激缩足反应潜伏期(paw withdrawal latency, PWL)和运用条件性逃避/回避(a place escape/avoidance paradigm)实验方法测试大鼠的情绪性疼痛。(3)延迟折扣实验：训练两组大鼠选择立即得到的较小的食物奖赏或延迟的较多的食物奖赏,建立延迟折扣模型,分别注射I2受体配体CR4056、μ阿片受体激动剂Morphine和α2受体激动剂Clonidine后,测试正常状态下三种镇痛剂对大鼠的冲动行为的影响；药物测试完成后其中一组大鼠接受坐骨神经慢性压迫性损伤手术,另一组大鼠仅暴露坐骨神经(假手术),再次分别注射CR4056、Morphine和Clonidine,测试在疼痛状态下三种镇痛剂对大鼠的冲动行为的影响。(4) Western blot实验：四组SD大鼠,分别为SS(脚掌注射盐水+腹腔注射生理盐水)组、CS(脚掌注射CFA+腹腔注射生理盐水)组、CB(脚掌注射CFA+腹腔注射10mg/kg2-BFI)组和SB(脚掌注射生理盐水+腹腔注射10mg/kg2-BFI)组,脚掌注射生理盐水或者CFA24h后,腹腔注射生理盐水或10mg/kg的2-BFI,30min后断头处死大鼠。分别取四组大鼠的海马和脊髓,运用分子生物学实验方法Western blot检测p-PKC、PKC、p-ERKERK在海马和脊髓中的变化。结果：(1)大鼠可以学习辨别出5.6mg/kg的2-BFI,10mg/kg的CR4056,5.6mg/kg的BU224和32mg/kg的Phenyzoline,大鼠经过100天训练仍无法辨别出Tracizoline和生理盐水。(2)在能辨别出2-BFI的大鼠中进行替代测试和组合测试,结果显示：I2受体其它配体CR4056、BU224、Tracizoline、RS45041和Idazoxan能完全替代2-BFI的辨别刺激效应；而仅Phenyzoline不能替代2-BFI的辨别刺激效应。Morphine和Methadone部分替代2-BFI的辨别刺激效应。在组合测试中,Tracizoline和Phenyzoline不影响2-BFI的辨别刺激效应,Idazoxan增强2-BFI的辨别刺激效应；Naltrexone、 Haloperidol和MDL100907均不影响2-BFI的辨别刺激效应。(3)在能辨别出CR4056的大鼠中进行替代测试和组合测试,结果显示：I2受体其它配体Tracizoline、Phenyzoline、RS45041和Idazoxan能完全替代CR4056的辨别刺激效应；而BU224不能替代CR4056的辨别刺激效应；2-BFI部分替代CR4056的辨别刺激效应。Morphine部分替代CR4056的辨别刺激效应；其它神经递质系统配体Ketamine、Clonidine、Harmane和Methamphetamine不能替代CR4056的辨别刺激效应。在组合测试中,Idazoxan、Tracizoline和BU224增强CR4056的辨别刺激效应,使CR4056的辨别刺激效应曲线向左移动。Yohimbine、 Naltrexone、Haloperidol和MDL100907均不能替代CR4056的辨别刺激效应,且不影响CR4056的辨别刺激效应。(4)在能辨别出BU224的大鼠中进行替代测试和组合测试,结果显示：I2受体其它配体2-BFI、CR4056、Tracizoline、Phenyzoline、RS45041和Idazoxan能完全替代BU224的辨别刺激效应。其它神经递质系统配体Morphine、Ketamine和Clonidine部分替代BU224的辨别刺激效应；Methamphetamine不能替代BU224的辨别刺激效应；与CR4056和2-BFI组大鼠不同的是,Harmane和Yohimbine可剂量依赖替代BU224的辨别刺激效应。在组合测试中,Idazoxan并不影响BU224的辨别刺激效应,而Tracizoline能增强BU224的辨别刺激效应。Naltrexone、 Haloperidol和MDL100907均不能替代BU224的辨别刺激效应,且不影响BU224的辨别刺激效应。(5)在能辨别出Phenyzoline的大鼠中进行替代测试和组合测试,结果显示：I2受体其它配体2-BFI、BU224、CR4056、Tracizoline、RS45041和Idazoxan能完全替代Phenyzoline的辨别刺激效应。其它神经递质系统配体Morphine、Ketamine和Clonidine部分替代Phenyzoline的辨别刺激效应；Methamphetamine不能替代Phenyzoline的辨别刺激效应；与BU224组大鼠相似,Harmane和Yohimbine可剂量依赖替代Phenyzoline的辨别刺激效应。在组合测试中Naltrexone、Haloperidol和MDL100907均不影响Phenyzoline的辨别刺激效应。(6)I2受体配体(2-BFI、BU224和Tracizoline)剂量依赖减弱CFA诱导的炎性疼痛。I2/α2受体拮抗剂Idazoxan减弱2-BFI在CFA炎性疼痛模型和CCI神经性疼痛模型中的镇痛效应。2-BFI可以增强Morphine的镇痛效应,表现出相加的效应。在CFA炎性疼痛模型和CCI神经性疼痛模型中,2-BFI和CR4056反复给药7-9d后不产生药物耐受和交叉耐受。在CFA炎性疼痛模型和CCI神经性疼痛模型中,I2受体配体(2-BFI、BU224和CR4056)能减弱大鼠的情感性疼痛。(7)成功建立延迟折扣模型,大鼠在没有延迟折扣的情况下,整个训练过程大鼠都选择较多的食物奖赏,在有延迟折扣的情况下,随着得到食物奖赏延迟时间的延长,大鼠逐渐从选择延迟的较多食物奖赏转向选择立即的较少的食物奖赏。I2受体配体CR4056不影响正常大鼠的冲动行为,μ阿片受体激动剂Morphine和α2受体激动剂Clonidine明显增强大鼠的冲动行为；在疼痛状态下,CR4056、Morphine和Clonidine对大鼠冲动行为的影响与正常状态下对大鼠冲动行为的影响一致；疼痛本身并不影响大鼠的冲动行为。(8)各组大鼠海马区或者脊髓L4-L6节段的p-PKCε和PKCs无显著性差异；海马区的p-ERK1/2和ERK1/2亦无显著性差异,但是CS组ERK1/2磷酸化有一定增强的趋势。在脊髓L4-L6节段,CFA诱导的疼痛和Ⅰ2受体配体2-BFI都能增强ERK1/2的磷酸化,而且2-BFI能减少ERK1/2的表达。结论：(1)大鼠可以辨别出大部分Ⅰ2受体相关配体(2-BFI、CR56、BU224和Phenyzoline),其辨别刺激效应由Ⅰ2受体特异性介导,而与μ阿片受体、α2受体、5-HT2受体、NMDA受体以及多巴胺D2受体等无关。这些结果表明Ⅰ2受体配体具有显著的精神活性,能够产生特异性的主观效应。(2)Ⅰ2受体相关配体具有类似的药理学机制,但并不完全一致,提示可能存在Ⅰ2受体亚型,而各配体对Ⅰ2受体亚型具有不同的亲和性。与现有文献报道结果不同的是,Idazoxan不具有Ⅰ2受体拮抗剂特征,而与BU224类似,表现出Ⅰ2受体的部分激动剂特征。(3)不同的Ⅰ2受体配体均可明显减弱大鼠的神经性和炎性疼痛,长期使用不产生耐受和交叉耐受效应,且其对大鼠冲动行为的影响与其他镇痛药不同。这提示Ⅰ2受体配体有可能开发成为一类全新作用机制的镇痛药。(4) PKCε/ERK通路可能不参与调控12受体产生镇痛效应的分子机制,其具体镇痛机制尚需进一步探讨。