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研究背景目前研究显示Wip1在多种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中高表达,但Wip1在结直肠癌中的表达情况及Wip1对结直肠细胞生物学行为的影响及机制尚不清楚。研究目的明确Wip1在结直肠癌组织及正常组织中的表达情况,分析Wip1表达与临床病理间的关系。初步探讨Wip1对结直肠癌细胞活性、增殖、侵袭与迁移的影响及机制。研究方法(1)采用Real time PCR法检测Wip1 mRNA在35对新鲜结直肠癌组织及对应正常组织中的表达情况;(2)采用Western blot法检测Wip1蛋白在35对新鲜结直肠癌组织及对应正常组织中的表达情况;(3)采用免疫组化法检测Wip1蛋白在100对结直肠癌组织及对应正常组织中的阳性表达情况,并根据表达情况分组,探讨与临床病理之间的关系。(4)在 LoVo、HT29、HCT116、DLD1、RKO、SW480 6 种细胞株中筛选Wip1表达最高的2种细胞系;分析数据库数据,寻找在结直肠癌中高表达且与Wip1相关的基因;(5)在筛选出的细胞系中,采用RNAi及质粒转染方法构建敲降Wip1表达及过表达上述基因的细胞株;(6)MTT法、克隆形成法、Transwell法、细胞划痕法检测不同细胞株的活性、增殖、侵袭及迁移能力;(7)初步探讨Wip1影响上述生物学行为的机制。研究结果(1)Real time PCR法结果显示,Wp1 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织中的表达水平(p=0.002),且T3+T4期中的表达水平明显高于T1+T2期中的表达水平(p<0.001),有淋巴结转移组表达水平高于无淋巴结转移组水平(1p<0.001);(2)Western blot法结果显示,Wip1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织中的表达水平(P<0.001);(3)免疫组化法结果显示,Wip1阳性表达主要位于细胞浆内,结直肠癌组织中Wip1阳性表达分级及阳性评分均高于正常组织,差异有统计学意义。Wip1高表达与术前CEA ≥5 ng/ml(p<0.001)、大体分型为溃疡型(p=0.030)、分化程度低(p=0.007)、T分期晚(p=0.010)、伴淋巴结转移(p<0.001)、pTNM分期晚(p<0.001)、伴脉管瘤栓(p=0.005)、伴神经侵犯(p=0.001)等因素密切相关。(4)HCT116、LoVo为2种Wip1表达最高的细胞系;成功筛选在结直肠癌中高表达且与Wip1相关的癌基因KPNA2;(5)成功构建 HCT116si-Wip1+NC、LoVosi-Wip1+NC、HCT116si-NC+KPNA2、LoVosi-NC+KPNA2 HCT116si-Wip1+KPNA2、LoVosi-Wip1+KPNA2、HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC细胞株;(6)MTT法、克隆形成法、Transwell法、细胞划痕法显示HCT116si-Wip1+NC、LoVosi-Wip1+NC 相较于 HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC 活性、增殖、侵袭及迁移能力减弱,差异有统计学意义(p<0.05);HCT116si-NC+KPNA2、LoVosi-NC+KPNA2相较于HCT116si-NC+NC、LoVosi-NC+NC上述能力均增强,差异有统计学差异(p<0.05);HCT116si-Wip1+KPNA2、LoVosi-Wip1+KPNA2可一定程度上逆转敲降Wip1导致的上述能力降低;(7)Western blot法显示,敲降Wip1表达,导致p-AKT表达降低,而p-GSK-3p表达升高,与过表达KPNA2结果相反;Real time PCR法结果显示,结直肠癌组织中Twist mRNA表达明显高于正常组织,差异有统计学意义(p<0.05),与Wip1 mRNA、KPNA2 mRNA表达均具有正相关关系;而E-cadmRNA在结直肠癌组织中的表达明显低于正常组织,差异有统计学意义,与Wip1 mRNA、KPNA2 mRNA表达均具有负相关关系(p<0.05)。研究结论(1)Wip1 mRNA及Wip1蛋白在结直肠癌组织中的表达水平均高于在正常组织中的表达水平,差异有统计学意义;Wip1蛋白高表达与分化程度差、pTNM分期晚、伴有脉管瘤栓及神经侵犯等指标密切相关。(2)敲降Wip1表达可显著降低结直肠癌细胞株的活性、增殖、侵袭及迁移能力,而再过表达KPNA2后,可一定程度地逆转上述结果。Wip1可能通过KPNA2活化AKT/GSK-3β信号通路、上调转移相关蛋白Twist表达等途径影响结直肠癌发生发展、侵袭转移。