背景人源化小鼠是指具有人组织、细胞,或者表达人基因的小鼠模型,是研究人类疾病和生物学的重要工具。在免疫学领域,人源化小鼠模型主要指在免疫缺陷小鼠中重建功能性人免疫系统的小鼠模型。经过近三十年的发展,人源化小鼠的构建方法不断改进,人免疫系统的组成和功能日臻完善,已经被广泛应用到生物医学的研究中,如感染、自身免疫性疾病、移植免疫和肿瘤等。其中,通过联合移植人胚胎胸腺组织和胚胎肝脏来源的CD34~+造血干/祖细胞所建立的免疫系统人源化小鼠,在领域内具有重要的影响力。它不仅具有多谱系、高水平的人适应性和天然免疫系统重建,如T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等,而且人T细胞是在所移植的人胚胎胸腺组织中发育的,具有HLA限制性。此外,它的外周免疫器官如脾脏和淋巴结中具有人免疫细胞组成的结构,如脾脏中的白髓。然而,该人源化小鼠模型肝脏中人免疫系统发育水平仍然相对较低。肝脏细胞占肝脏所有细胞的70-80%。肝脏作为人体的重要器官,它具有代谢、解毒、分泌胆汁、蛋白质合成、储存糖原等功能,这些功能主要是通过肝脏细胞实现的。肝脏也是一个具有免疫耐受特性和防御性免疫反应平衡的免疫器官,它具有丰富的免疫系统组成,包括枯否(Kupffer)细胞、NK细胞、NK-like T(NKT)细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)等。据报道,肝脏细胞在肝脏免疫耐受的诱导和维持中具有重要作用,例如,肝脏细胞移植能够诱导同种异基因移植的免疫耐受;肝脏细胞也能通过上调表达Jagged1,与T细胞表面Nocth受体结合,诱导耐受性T细胞的产生。然而,肝脏细胞是否在肝脏特异的免疫系统发育和形成中发挥作用,目前并没有明确的证据。肝-免疫人源化小鼠是指同时具有人肝脏细胞嵌合和人免疫系统重建的小鼠模型。它在研究肝炎病毒HBV和HCV的免疫反应和肝脏免疫病理变化中具有重要应用。然而,在该小鼠中,人肝脏细胞对人免疫系统的发育产生何种影响,仍需要深入的研究。免疫缺陷小鼠肝损伤的特性,对构建肝-免疫人源化小鼠模型是十分重要的。uPA/SCID小鼠(SCID小鼠肝脏中转基因过表达uPA)是具有肝损伤的免疫缺陷小鼠,能够有效的重建人肝脏细胞。然而,uPA/SCID小鼠具有一些缺点:1,自发肝损伤,导致实验窗口必须限制在出生3周以前;2,同源重组导致的转基因丢失;3,繁育能力低。这严重限制了其广泛应用。因此,开发一种可以调控uPA功能的新策略,从而克服上述限制,在领域内十分重要。目的在本课题中,我们首先优化抗小鼠Fas抗体(Jo2)诱导免疫缺陷小鼠肝损伤的实验方案,并评估人胚胎肝脏细胞重建的效果;然后建立肝-免疫人源化小鼠模型,研究人肝脏细胞对人免疫系统发育的影响;此外,我们将探讨基于uPA的小鼠肝损伤新策略及其在理论上的可行性(即uPA-ERT2融合表达时,ERT2是否能够调控uPA的功能);我们用NOD/SCID小鼠制备了肝脏特异表达uPA-ERT2的转基因小鼠(NOD/SCID-uPA-ERT2)。方法我们首先建立基于抗小鼠Fas抗体(Jo2)处理的免疫缺陷小鼠肝损伤模型,通过移植人胚胎肝脏细胞,建立人胚胎肝脏细胞重建的小鼠。通过ELISA、免疫组化和qRCR的方法,评价人胚胎肝细胞重建和发育的情况。然后,我们在人胚胎肝细胞重建的基础上,再对小鼠进行同源人胚胎胸腺组织和胚胎肝脏来源CD34~+细胞联合移植,建立肝-免疫人源化小鼠。通过流式、免疫组化、多色免疫组化和qPCR方法研究人肝脏细胞对外周血、脾脏和肝脏中人免疫系统发育的影响,并且探索可能导致相应影响的原因。通过体外人肝脏细胞和人免疫细胞共培养实验,进一步验证肝脏细胞对免疫细胞存活和扩增的影响。最后,我们设计了基于uPA的小鼠肝损伤新策略,即融合表达uPA-ERT2,并通过细胞迁移实验和uPA酶活性实验,验证ERT2能否能通过它的配体4羟基他莫昔芬(4OH-T)调控uPA的功能。构建基于Tol2转座子系统的载体Mouse albumin promoter/enhancer-uPA-ERT2-pA,和转座酶一起显微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵,制备NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠。结果注射不同剂量的Jo2抗体(0,0.2,0.4,0.9mg/kg),导致NCG免疫缺陷小鼠血清中ALT的水平显著不同,HE实验显示肝损伤的情况不同。Jo2导致的肝脏细胞死亡主要发生在血管周围。我们发现,不同剂量的Jo2抗体,能够导致小鼠存活的概率不同,分别注射0,0.3,0.4,0.5mg/kg Jo2抗体,48小时内小鼠的存活率分别为100%,100%,67%,33%。间隔24小时连续注射两次Jo2(0.3mg/kg),能够产生持续的肝损伤。连续注射Jo2(0.3mg/kg/3天)10周,NCG小鼠是健康的。人胚胎肝脏细胞经脾脏移植给NCG小鼠,在移植后24小时,可以观察到人胚胎肝脏细胞从小鼠脾脏向肝脏的转移。这些小鼠经过0.3mg/kg/3天的Jo2抗体持续处理10周,外周血中具有持续的、逐渐升高的人白蛋白分泌。免疫组化检测到小鼠肝脏组织中具有人肝脏细胞的重建。应用qPCR比较重建人胚胎肝脏细胞的小鼠肝组织、人胚胎肝组织和成人肝组织中人肝脏细胞特异的代谢基因表达,如CYP1A2(Cytochrome P450 1A2)和CYP2D6(Cytochrome P450 2D6),Phase II酶UGT1A1(Bilirubin UDP-glucuronosyltransferase 1-1),和Transpotors MRP2(Multidrug resistance-associated protein 2)和NTCP(Na+/taurocholate Cotransporting),我们发现人胚胎肝脏细胞在小鼠肝脏中有向成人肝脏细胞方向发育的趋势,但仍然不及成人肝脏细胞成熟。NCG小鼠中重建人胚胎肝脏细胞后,再经过人胚胎胸腺组织和胚胎肝脏来源CD34~+细胞联合移植,应用Jo2进行小鼠肝损伤诱导来促进人肝脏细胞的重建,即可建立肝-免疫人源化小鼠模型。该小鼠的外周血中具有持续的人白蛋白分泌,肝脏中具有人肝脏细胞的重建。该肝-免疫人源化小鼠,相比于免疫系统人源化小鼠,外周血和脾脏中人免疫细胞水平没有明显的区别,脾脏中人免疫细胞亚群包括CD3~+CD4~+T、CD3~+CD4~+T、CD19~+B和CD14~+单核/巨噬细胞的比例也没有明显区别;而肝脏中的免疫细胞的水平,包括CD68~+巨噬细胞、CD11c~+树突状细胞和CD94~+NK细胞,却有明显的升高。进一步研究发现,在肝-免疫人源化小鼠的肝脏中,人肝脏细胞富集的区域具有更多的人免疫细胞重建,这些人免疫细胞包括CD68~+单核/巨噬细胞、CD11c~+树突状细胞和CD94~+NK细胞。重建在小鼠肝脏中的人肝脏细胞能够分泌一系列造血细胞因子,包括IL-3、GM-CSF、M-CSF和IL-15,以及免疫细胞趋化因子MCP-1、CXCL-1和CXCL-10。此外,体外共培养实验证明,人肝脏细胞能够促进人免疫细胞存活和扩增,这些细胞包括CD33~+细胞,NKp46~+细胞,和CD3~+细胞。4T1-uPA-2ERT2细胞系的迁移能力和4T1-GFP相似,都明显低于4T1-uPA。当加入ERT2的配体4OH-T时,尽管它能抑制4T1细胞系的迁移,但是4T1-uPA-2ERT2的迁移能力变得和4T1-uPA一样,即4OH-T处理后的4T1-uPA-ERT2提高了迁移能力。此外,4OH-T处理后,瞬转的293FT-uPA-ERT2细胞的培养上清液和细胞裂解的蛋白中uPA的酶活性升高,并且是4OH-T剂量依赖的。这些结果证明,ERT2能够通过4OH-T调控uPA的酶活性。此外,我们共得到20只F0代NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠,随机抽取的10只得到DNA测序的进一步验证。RT-PCR实验表明uPA-ERT2特异在NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠的肝脏中表达。与NOD/SCID小鼠相比,NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠有一定程度的肝损伤,这可能是由于uPA-ERT2存在一定程度的渗漏。NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠分离的肝脏细胞在体外培养的过程中,经过4OH-T处理后,培养上清液中uPA的酶活性升高。更重要的是,NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠经过他莫昔芬灌胃处理后,血清中uPA的酶活性和ALT水平明显升高。结论人胚胎肝脏细胞能够在基于Jo2的肝损伤NCG小鼠中有效的重建,它们具有肝向成熟肝脏细胞方向发育的趋势;在肝-免疫人源化小鼠中,人肝脏细胞对外周血和脾脏中的人免疫系统发育没有明显的影响,而对肝脏中人免疫系统的发育具有显著的促进作用;人免疫细胞和人肝脏细胞在位置上共定位,即肝-免疫人源化小鼠肝脏中重建人肝脏细胞的区域具有更多的人免疫细胞;重建的人肝脏细胞能够分泌一系列造血细胞因子和免疫细胞趋化因子;在体外,人肝脏细胞能够促进人免疫细胞的存活和扩增;通过体外实验、离体实验和体内实验,我们证明ERT2能够通过它的配体4OH-T调控uPA的功能。NOD/SCID-uPA-ERT2小鼠通过他莫昔芬能够能够提高肝损伤。