本学位论文以世界性果蔬重要害虫桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)为研究对象，基于实验室筛选得到的桔小实蝇对马拉硫磷的抗性及敏感品系，首先从生化水平出发，通过增效剂实验明确了羧酸酯酶参与桔小实蝇对马拉硫磷抗性的形成；同时，利用生物信息学方法分析桔小实蝇中肠转录组数据库，并且结合实时荧光定量PCR技术解析了羧酸酯酶基因在桔小实蝇抗性品系主要解毒代谢组织中的差异表达特性，从而筛选得到2个α羧酸酯酶基因作为后续功能验证目的基因；最后，分别利用RNAi技术以及真核表达技术从基因沉默及过表达两个方面深入解析了这2个α羧酸酯酶基因的分子特性和相关功能，以期为研究桔小实蝇抗性发生的分子机理奠定基础，主要研究结果如下：　　1羧酸酯酶特异性抑制剂对马拉硫磷的增效作用　　利用羧酸酯酶特异性抑制剂 TPP分别测定了其对马拉硫磷作用于桔小实蝇抗性及敏感品系的增效作用。结果发现，TPP能够显著增强马拉硫磷对桔小实蝇抗性及敏感品系的毒杀作用。其中，TPP对马拉硫磷作用于桔小实蝇敏感品系的增效比是3.97，对抗性品系的增效比是8.21，二者相差2.06倍，相对增效系数为0.86。该研究结果表明羧酸酯酶在桔小实蝇对马拉硫磷抗性及敏感品系中均具有重要的解毒代谢功能，并且在生化水平上证实了羧酸酯酶参与介导桔小实蝇对马拉硫磷的抗性形成。　　2桔小实蝇羧酸酯酶候选基因筛选　　利用本课题组已报告的桔小实蝇中肠转录组数据分析结果，从中筛选得到与昆虫酯酶E3同源性最高的2条α羧酸酯酶基因序列信息。为进一步验证得到的2个α羧酸酯酶基因与抗性相关，采用实时荧光定量PCR技术对这2个基因在桔小实蝇抗性及敏感品系的不同组织中的表达模式进行比较研究，结果显示这2个α羧酸酯酶基因（BdCarE4和 BdCarE6）在抗性品系的整虫、中肠及脂肪体中的表达量均显著性上调。在抗性品系中两个主要解毒代谢组织中的差异表达暗示这2个基因在介导马拉硫磷抗性形成中的潜在生理功能，因此，选取 BdCarE4和BdCarE6作为后续基因功能验证的目的基因。　　3桔小实蝇BdCarE4和BdCarE6序列及系统发育分析　　克隆得到了桔小实蝇BdCarE4（KP698938）和BdCarE6（KP698939）的cDNA全长序列。功能区域预测分析发现这2个基因编码的蛋白与酯酶和脂肪酶具有较高同源性，属于羧酸酯酶家族（EC:3.1.1.1）。这2个基因编码的蛋白均具备包括以丝氨酸（Ser）为中心的催化三联体以及氧离子洞在内的羧酸酯酶典型的5个保守结构域，表明这2个蛋白具有催化水解活性。通过构建涵盖11个羧酸酯酶簇的系统发育树，发现BdCarE4和BdCarE6均聚到clade B，属于高等双翅目α羧酸酯酶。此外，这2个基因编码的羧酸酯酶与昆虫酯酶E3/αE7同源性最高，暗示BdCarE4和BdCarE6可能与昆虫酯酶E3具有相似的介导抗性形成的功能。因此，序列和系统进化分析，初步揭示这2个基因可能具备的生理功能，为后续的功能验证奠定了分子基础。　　4桔小实蝇BdCarE4和BdCarE6基因时空表达模式分析　　利用实时荧光定量PCR技术对BdCarE4和BdCarE6在桔小实蝇不同发育阶段的表达特性进行分析。结果显示，BdCarE4和BdCarE6在桔小实蝇的卵期、幼虫期、蛹期以及成虫期均有所表达，且表达量从卵期到成虫期逐渐上升，在5日龄成虫中达到最高值。同时，检测这2个基因在桔小实蝇成虫不同组织中的表达特性，结果显示，BdCarE4在成虫中肠和马氏管中显著性高表达，BdCarE6在成虫脂肪体和马氏管中显著性高表达。这种特异性的表达特性说明 BdCarE4和BdCarE6可能在桔小实蝇主要接触杀虫剂时期以及主要解毒代谢组织中具有重要的生理功能，进一步暗示这2个基因可能参与桔小实蝇对马拉硫磷抗性的形成。　　5基于RNAi技术的桔小实蝇BdCarE4和BdCarE6基因的功能鉴定　　采用RNAi技术抑制BdCarE4和BdCarE6基因在马拉硫磷抗性品系中的表达量，通过检测基因特异性沉默效率并进行马拉硫磷生物测定，从而深入探究这2个α羧酸酯酶基因在介导桔小实蝇马拉硫磷抗性形成中的作用。分别注射BdCarE4和BdCarE6基因dsRNA，24 h后检测发现在桔小实蝇整虫中对目的基因的沉默效果明显。进一步对沉默目的基因的试虫进行马拉硫磷生物测定，结果表明分别注射了dsBdCarE4和dsBdCarE6的桔小实蝇对马拉硫磷的敏感性显著提高，在相同剂量处理下，目的基因沉默后后的成虫死亡率更高，死亡速率显著性加快。与对照相比，注射dsBdCarE4和dsBdCarE6的桔小实蝇死亡率分别提高了40％和22%，致死中时间分别缩短为对照的54%和61%。上述研究结果表明抑制 BdCarE4和BdCarE6的表达严重影响了桔小实蝇对马拉硫磷的解毒代谢，从而证实 BdCarE4和BdCarE6参与了桔小实蝇对马拉硫磷的抗性形成。　　6桔小实蝇BdCarE4和BdCarE6基因功能表达及活性分析　　参照 Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，成功实现了在昆虫细胞 Sf9中对BdCarE4和BdCarE6基因进行重组蛋白体外表达。以α-NA为底物对表达产物进行酶活性分析，结果表明，表达有BdCarE4和BdCarE6蛋白的Sf9细胞羧酸酯酶特异性酶活性显著增高，分别是对照细胞活性的7.48和9.53倍，说明BdCarE4和BdCarE6在Sf9细胞中得到成功表达，且获得较高活性的可溶性蛋白。细胞毒性测定结果发现表达有BdCarE4和BdCarE6的Sf9细胞在马拉硫磷诱导下具有更高的细胞活性，进一步证实了BdCarE4和BdCarE6在桔小实蝇对马拉硫磷代谢解毒过程中的重要生理功能。　　综上所述，本学位论文研究综合利用生化毒理学、生物信息学和分子生物学技术从桔小实蝇中鉴定出参与介导桔小实蝇对马拉硫磷抗性形成的2个α羧酸酯酶基因。全面解析了这2个α羧酸酯酶基因的序列特征、系统进化关系、时空表达模式；并且综合运用RNA干扰和真核表达两种方法，分别从基因沉默和基因过表达两个层面对这2个基因的功能进行了分析。本学位论文研究结果为开展桔小实蝇的抗性治理以及挖掘羧酸酯酶家族基因在昆虫体内所承担的生理功能等工作奠定了基础。