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研究目的：1.研究七氟醚预处理是否有延迟性心肌保护作用；2.探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)和线粒体通透性转换孔(MPTP)在七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用中角色；3.观察七氟醚预处理24小时后对大鼠心肌线粒体蛋白质组的影响；4.电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氧酶(NADH-DH)在七氟醚预处理后的表达改变。研究方法研究分为四部分：1.七氟醚预处理是否有延迟相的减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。健康雄性SD大鼠随机分为4组(n=12)：假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理后24h组(SEVO-24H组)和七氟醚预处理后48h组(SEVO-48H组)。SHAM组大鼠开胸后左冠状动脉前降支(LAD)只套线,不结扎；IR组大鼠LAD结扎阻断30min后再灌注120min；SEVO-24H组大鼠吸入2.5%七氟醚60min,24h后建立心肌缺血再灌注模型；SEVO-48H组大鼠吸入2.5%七氟醚60min,48h后建立心肌缺血再灌注模型。每组6只大鼠分别记录各组缺血前(T0)、缺血30min(T1)、再灌注30min(T2)、再灌注60min(T3)和再灌注120min(T4)时刻心率(HR)、平均动脉压(MAP)并计算心率收缩压乘积(RPP);再灌注结束后取颈内动脉血测定肌钙蛋白(cTnl),然后处死动物,伊文氏蓝和TTC染色法测心肌梗死面积。每组另6只动物于再灌注结束时电镜下观察各组心肌超微结构,并取心脏左室检测心肌ATP含量和分离线粒体检测线粒体呼吸控制率(RCR)；检测心肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；免疫印记法检测心肌胞浆内细胞色素C(Cyto C)含量,以及心肌Bcl-2和Bax蛋白表达,分离心肌线粒体观察线粒体在200μM[Ca2+]环境下A520改变(提示线粒体肿胀程度),来判断MPTP通透性改变。2.Mito-KATI和MPTP在七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用中角色。健康雄性SD大鼠随机分为11组(n=6)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理组(SEVO组)、5-羟基癸酸(触发)+七氟醚预处理组[5-HD(T)+SEVO组]、5-羟基癸酸(触发)组[5-HD(T)组]、七氟醚预处理组+5-羟基癸酸(调节)+[SEVO+5-HD(M)组]、5-羟基癸酸(调节)组[5-HD(M)组]、苍术苷(触发)+七氟醚预处理组[ATR(T)+SEVO组]、苍术苷(触发)组[ATR(T)组]、七氟醚预处理+苍术苷(调节)组[SEVO+ATR(M)组]、苍术苷(调节)组[ATR(M)组]。SHAM组开胸不建立心肌缺血再灌注模型,IR组采取结扎LAD30min后再灌注120min建立在体心肌缺血.再灌注模型,SEVO组在建立心肌缺血再灌注模型前给予2.5%七氟醚吸入共60min。5-HD(T)+SEVO组、5-HD(T)组、ATR(T)+SEVO组组和ATR(T)组分别于七氟醚(氧气)吸入前10min给予5-HD(5mg/kg)或者ATR(5mg/kg)；SEVO+5-HD(M)组、5-HD(M)组.、SEVO+ATR(M)组和ATR(M)组于LAD结扎前15min给予5-HD或者ATR。记录缺血再灌注过程中血流动力学指标HR、MAP和计算RPP,再灌注结束时比较各组心肌梗死面积和血清肌钙蛋白(cTnl)水平,电子显微镜下观察心肌超微结构。3.观察2.5%七氟醚预处理2/4小时后对大鼠心肌线粒体蛋白质组的影响。健康雄性SD大鼠随机分为3组(n=6)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)和2.5%七氟醚预处理组(SEVO组)。IR组大鼠采取结扎LAD30min后再灌注120min建立心肌缺血再灌注模型,SEVO组大鼠吸入2.5%七氟醚(共60min)2/4h后建立心肌缺血再灌注模型,SHAM组.不建立工R模型。于再灌注120min后取心肌左室,采用差速离心结合密度梯度分离线粒体,双向凝胶电泳法(2-DE)分离线粒体蛋白质,分析凝胶图像后找出差异蛋白,并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白,并用免疫印记法验证其中的两个蛋白电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH-DH)。4.电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH-DH)在七氟醚预处理后表达变化。健康雄性SD大鼠随机分为7组(n=12)。假手术组(SHAM组)、缺血再灌注组(IR组)、七氟醚预处理组(SEVO组)、mitoKATP|沮断剂5-HD(5mg/kg)+七氟醚预处理组(5-HD+SEV0组)、活性氧清除剂2-MPG (20mg/kg)+七氟醚预处理组(MPG+SEVO组)、单独5-HD组和MPG组。5-HD组和2-MPG组均在七氟醚(或者氧气)吸入前10min静脉给予,每组6只大鼠于七氟醚(或氧气)预处理后/4h采用RT-PCR检测心肌VDAC1和NADH-DH的mRNA表达。除SHAM组外,其它各组大鼠于24h后采用结扎LAD的方法建立在体缺血再灌注模型,缺血30min后再灌注120min。再灌注120结束时检测心肌梗死面积和血清cTnI,电镜下观察心肌超微结构,Western blot法检测心肌VDAC1和NADH-DH,以及Bcl-2和Bax表达。研究结果：1.除SHAM组外,其它各组大鼠心肌缺血再灌注过程中HR、MAP和RPP均下降,但是各时间点组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与SHAM组比较,IR组心肌缺血再灌注后显示明显的心肌梗死面积和心肌cTnI释放(P<0.05),电镜下观察到心肌形态改变提示心肌损伤严重。同时IR组线粒体功能明显受损,包括线粒体RCR降低和心肌ATP含量明显减少；心肌MDA含量增加而SOD活性降低；细胞浆Cyto C释放增加,Bcl-2/Bax比率降低,而线粒体通透性增加(与SHAM组比较,P<0.05)。而七氟醚预处理后24h和48h均能够减少缺血再灌注后心肌梗死而积和cTnI释放,电镜下观察心肌损伤亦减轻(与IR组比较,P<0.05)。七氟醚预处理24h和48h也能增加缺血再灌注后线粒体RCR和心肌ATP含量；降低MDA含量而增加SOD活性；减少细胞浆Cyto C,增加Bcl-2/Bax比率,降低线粒体通透性转换孔开放(与IR组比较,P<0.05)。但是SEVO-24H组和SEVO-48H组比较,在减少心肌坏死和线粒体损伤方而差异均无统计学意义(P>0.05)。2.应用2.5%七氟醚预处理24h后能够减少心肌缺血再灌注后心肌梗死而积和心肌酶释放,心肌超微结构显示损伤减轻(与IR组比较,P<0.05)。在七氟醚预处理前或者在结扎LAD前给予mito-K阻断剂5-HD,都将取消七氟醚预处理的作用,使心肌梗死面积和血清cTnI增加(与SEVO组比较,P<0.05)。而只有在结扎LAD前给予MPTP开放剂ATR才能取消七氟醚减少心肌损伤的作用(与SEVO组比较,P<0.05),在七氟醚吸入前给予ATR对心肌梗死面积和血清cTnI没有影响(与SEVO组比较,P>0.05)。3.二维电泳后得到的凝胶分析显示SHAM组、IR组和SEVO组分析的蛋白质点数平均分别为615±8,634±13和611±9,其中表达差异大于或者等于1.5倍的点有21个。选取差异蛋白质进行质谱分析,初步鉴定小15个蛋白质。这些蛋白质包括三羧酸循环相关酶如丙酮酸脱氢酶(PDH),支链a-酮酸脱氢酶(BCKDH),异柠檬酸脱氢酶(ICDH):电子传递连相关成分包括NADH脱氢酶(NADH-DH),细胞色素C脱氢酶(COX),电子传递黄素蛋白(ETF)和ATP合酶；转运蛋白类如电压依赖性阴离子通道(VDAC)和线粒体内膜转运体(Tim9B):以及线粒体蛋白合成延长因子(EFTu).这些差异蛋白与能量的生成密切相关,除了BCKDH和EFTu外,这些蛋白质在缺血再灌注损伤后表达减少,而七氟醚预处理能够很大程度上挽回这些蛋白质损失(P<0.05)。七氟醚引起的线粒体蛋白质组改变,整体上提示线粒体能量产生和转运增加,有利于缺血再灌注后心肌能量的恢复。4.七氟醚预处理能够减少心肌梗死面积与cTnI释放(与IR组比较,P<0.05),它的作用被预处理前给予5-HD和2-MPG取消(与SEVO组比较,P<0.05)。七氟醚预处理后4h即发现VDAC1和NADH-DH的mRNA表达增加(P<0.05),与SEVO组比较,5-HD+SEVO组和MPG+SEVO组的VDAC1和NADH-DH的mRNA水平均下降(P<0.05)。七氟醚预处理24h后心肌VDAC1和NADH-DH蛋白表达增加,而事先给予5-HD和2-MPG能够取消七氟醚预处理引起的蛋白质改变(P<0.05)。研究结论：大鼠在体实验研究结果表明：1.七氟醚预处理(2.5%吸入60min)具有延迟性心肌保护作用,能减少在体大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌坏死和线粒体损伤。2. Mito-KATP在七氟醚预处理延迟性心肌保护作用的触发阶段以及调节阶段均起作用,而MPTP只在调节阶段起作用。3.七氟醚预处理24小时后心肌的线粒体蛋白表达谱发生改变,初步鉴定出的差异蛋白质提示,七氟醚预处理的延迟性心肌保护作用可能与线粒体蛋白质组重构有关。4.蛋白质组学找出的差异蛋白质VDACl和NADH-DH在七氟醚预处理后24h表达增加,可能是心肌保护蛋白,而mito-KTP和活性氧参与七氟醚预处理触发阶段启动基因转录。