基因治疗是将人正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的缺陷或错误，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗的目的。现在基因治疗已经进行了较多的研究，并且有一些研究已经进入临床试验阶段。现在全世界范围内已经批准的基因治疗临床试验方案超过了1200项，其中近70％是针对恶性肿瘤的治疗。在基因治疗的实施中，有四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的有效安全的转基因载体体系，三是选择合适有效的转基因途径，四是如何使治疗基因在靶细胞中特异性表达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因载体体系是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。目前基因治疗使用最多的转基因载体是腺病毒和逆转录病毒载体，约占治疗使用载体总数的50％。病毒载体具有很高的转基因效率，但使用病毒载体有许多缺点，主要包括病毒载体有较强的免疫原性，大量使用会产生较强的免疫反应，出现的首例基因治疗导致死亡的病例是在使用重组腺病毒载体治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶部分缺陷症的病人，由于大剂量注射重组病毒激发了机体严重的免疫反应，多器官衰竭导致死亡。此外病毒载体的应用还有出现插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体有限的携带DNA能力，不利于大规模的生产也是限制其应用的主要缺点。非病毒载体与病毒载体相比，其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原性，不具备插入突变的能力，易于大规模生产和生产成本较低。但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。理想的非病毒转基因载体应该是可以降解的，毒性很低的，有较高转基因效率，并且具备靶向到目标细胞或是组织的能力，使治疗基因在靶细胞或组织中发挥作用。为了寻找理想的非病毒转基因载体，目前以阳离子多聚物作为转基因载体的研究较多。其中一种阳离子多聚物多聚乙烯亚胺（PEI，polyethylenimine）研究是最多的。PEI是经过酸催化氮丙啶单体聚合，可以形成线型或分枝状的聚合物结构，有较高的阳性电荷，与带有阴性电荷的DNA或RNA结合能力较强，可以与DNA或RNA形成复合物粘附到细胞表面被细胞内吞。PEI有很多质子化的多级氨的氮原子，当溶酶体内的pH下降时，PEI能够大量捕获质子，并引起Cl^-内流，导致溶酶体渗透性肿胀，最后溶酶体破裂从而将内吞的DNA释放到细胞质（即质子海绵效应），DNA释放后进入细胞核中并表达。PEI的分子量的范围变化很大，一般应用于转基因载体的PEI的分子量在5000-25000 Da。高分子量的PEI转基因效率很高，如分枝状25000 DaPEI（PEI 25 kDa），但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低，但一般而言其转基因效率很低，并且PEI作为转基因载体直接体内应用会导致红细胞的聚集，可以与血液中的白蛋白等非特异性结合，导致聚合体的形成，体内应用转基因效率低，一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。修饰PEI的目的主要是降低PEI的毒性，提高PEI和DNA复合物的稳定性，提高靶向性，减少与白蛋白的非特异性结合，延长体内的时间等等。考虑到高分子量的PEI毒性很大，本研究选择低毒的低分子量PEI进行修饰，通过与羟丙基环糊精偶联形成新的共聚物，再经过系列试验筛选得到高转基因效率的新型转基因载体。并且提出一个新的设计非病毒转基因载体的思路，即选择一种低毒的多羟基化合物和另一种低毒的多氨基化合物，再选用合适的可以形成可降解的连接基团的试剂将二者连接起来，那么形成的共聚物是可降解的和低毒性的，经过进一步筛选以得到高效率的转基因载体，在此基础上再提高其靶向性，提高载体与靶点的特异结合能力。在目前肿瘤的基因治疗中，阻碍基因成功转移的一个主要原因是缺乏较强靶向肿瘤细胞或组织能力的转基因载体体系。为了提高转基因载体的靶向性，选择能与肿瘤特异性靶点特异结合的靶向物来修饰转基因载体显得非常重要。在人类20-30％乳腺癌和部分卵巢癌的细胞中，Her-2受体过度表达，目前有一些研究利用针对Her-2受体的曲妥珠单抗与非病毒载体偶联，以提高非病毒转基因载体靶向Her-2受体阳性肿瘤细胞的能力。但是抗体是较大的蛋白质，不宜重复给药。所以本研究考虑使用可以与Her-2受体特异结合的靶向性的寡肽与新型非病毒载体偶联，本研究根据文献报道，在噬菌体展示技术筛选得到的寡肽中选择了一条能与Her-2受体特异结合的高亲和力寡肽（其氨基酸序列是Met-Ala-Arg-Ala-Lys-Glu），与新型载体连接，以提高载体与Her-2受体阳性肿瘤细胞或组织的特异结合能力。通过在一些Her-2受体阳性的乳腺肿瘤和卵巢肿瘤细胞中进行转基因试验，最终研制出一种新型的具有靶向性，低毒，可降解的高效率转基因载体。本研究分两部分进行：第一部分，选择了水溶性好低毒性的多羟基化合物羟丙基环糊精（HPα-CD，2-羟丙基α-环糊精；HPβ-CD，2-羟丙基β-环糊精；HPγ-CD，2-羟丙基γ-环糊精）作为骨架，同时选择了低毒性的多氨基化合物，即低分子量多聚乙烯亚胺（分枝状PEI 600 Da和线型的PEI 423 Da）作为支链，通过一种可以形成可降解酯键的试剂羰二咪唑（CDI）进行连接形成新的共聚物，筛选出高效，低毒，可降解的新型载体。第二部分，通过一段靶向寡肽与新型载体的偶联（该寡肽可以与Her-2受体胞外段特异结合），从而使得新型载体具有一定靶向能力，提高特异性。经过体外体内的试验证实寡肽偶联的新型载体具备了靶向到Her-2受体的肿瘤细胞的能力，提高了在靶细胞的转基因效率，新型载体携带α-干扰素的真核表达质粒在荷瘤裸鼠的基因治疗中显示了较好的治疗效果。第一部分羟丙基环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺构建新型非病毒转基因载体目的：选用羟丙基环糊精系列作为骨架偶联低分子量PEI，以构建新型可降解，低毒，高效率转基因载体。方法：选择了多羟基化合物羟丙基环糊精作为骨架，同时选择了多氨基化合物低分子量PEI（分枝状PEI 600 Da和线型的PEI 423 Da）作为支链，通过试剂羰二咪唑进行连接形成多种新的共聚物，通过质子核磁共振波谱法，红外分光光度分析法，热分析法等表征手段对新合成的共聚物的结构进行验证，并通过质子核磁共振波谱法检测新共聚物的环糊精和PEI的相对组成。通过检测粒径大小，表面电荷以及通过DNA凝胶电泳阻滞试验来评估新共聚物缩合DNA的能力。通过MTT法检测共聚物对不同细胞毒性。以合成的共聚物为载体携带绿色荧光蛋白质粒进行多种细胞转染，观察细胞的绿色荧光，使用共聚物携带荧光素酶质粒进行多种细胞转染，再用化学发光仪检测荧光素酶与底物蛋白结合后显示的相对荧光强度，评估转染效率。并在有血清和无血清的培养液中，比较血清对载体的转染效率的影响。在接近生理条件下进行共聚物的可降解性检测。结果：经过多次合成得到了HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 423，HPγ-CD-PEI 423等多种新的共聚物。通过质子核磁共振波谱法，热分析法证实新共聚物的产生，红外分光光度分析法证实PEI 600，PEI 423分别是以酯键与羟丙基环糊精相连。并且使用质子核磁共振波谱法得到的积分数据分析了新的共聚物中环糊精和PEI的组成，其中HPγ-CD-PEI 600上的PEI 600接入最多，每分子HPγ-CD的羟丙基上约接上了3.3分子PEI 600，HPβ-CD-PEI 600中，每分子HPβ-CD的羟丙基上约接上了3.2分子PEI 600。HPα-CD-PEI 600中，每分子HPα-CD的羟丙基上约接上了1.66分子PEI 600。线型的PEI 423的接入要明显少于分枝状的PEI 600接入。粒径检测结果显示，HPα-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为400时（N／P比值，N／P Ratio，the number of nitrogen residues of PEI per DNA phosphate Ratio，PEI的氮摩尔数／DNA的PO₃^-摩尔数），粒径约为325 nm。HPβ-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为300时，粒径约195 nm。HPγ-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为40时，粒径约174 nm。表面电荷检测显示，HPα-CD-PEI 600／DNA复合物的表面电荷在N／P比值增加到200以上后，电荷基本维持在+10 mv以上，不超过+20mv；HPβ-CD-PEI 600／DNA复合物表面电荷当N／P比值增加到150以上后，电荷基本维持在约+20mv：HPγ-CD-PEI 600／DNA复合物在N／P比值增加到40以后，电荷基本维持在约+20mv。HPβ-CD-PEI 423和HPγ-CD-PEI 423／DNA复合物的最小粒径分别是约389 nm和468 nm，表面电荷在N／P比值增加到200以上后，维持在+10mv以上。DNA凝胶电泳阻滞试验中，HPα-CD-PEI 600在N／P比值为12∶1时，HPβ-CD-PEI 600在N／P比值为8∶1时可以完全阻滞DNA的迁移，HPγ-CD-PEI 600在N／P比值为4∶1时可以完全阻滞DNA的迁移。这表明共聚物有强的缩合DNA的能力。选择了其中缩合DNA的能力较强的HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600这三种共聚物作为转基因载体，进一步检测其毒性和转基因的效率。在不同的细胞中，均显示HPβ-CD-PEI 600毒性最低，HPα-CD-PEI 600其次，HPγ-CD-PEI 600毒性稍大，但它们的毒性都远小于PEI 25 kDa。从这些新共聚物中筛选出两种较高转染效率的新型载体，HPβ-CD-PEI 600的最高转染效率在不同的细胞的适宜N／P比值一般在300，HPγ-CD-PEI 600的适宜N／P比值一般在40或是60。HPβ-CD-PEI 600和HPγ-CD-PEI 600最高转染的效率与PEI 25 kD的转染效率相近或略高。HPαCD-PEI 600的转染效率较低。在有血清和无血清培养液转染试验中，PEI 25 k Da有血清存在的情况下转染COS-7细胞的转染效率最高值是无血清中转染效率最高值的62.2％，HPα-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率的最高值是无血清最高值的的89.0％，HPβ-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率最高值是无血清中最高值的的91.4％，HPγ-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率最高值是无血清中最高值的的98.4％。接近生理条件下，HPγ-CD-PEI 600是可以降解的共聚物。在处理48小时后，HPγ-CD-PEI 600偶联的PEI 600约减少了一半。讨论：合成得到了HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 423，HPγ-CD-PEI 423等多种新的共聚物。HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600缩合DNA的能力较强。从中筛选出HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600两种较高转染效率的新型载体。HPγ-CD-PEI 600达到最高转基因效率的N／P比值较低，所以使用量小于HPα-CD-PEI 600和HPβ-CD-PEI 600。HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600转染细胞时，转基因效率受血清影响较小，HPγ-CD-PEI 600转基因效率受血清影响最小。因为HPγ-CD-PEI 600的转基因效率高，用量小，在有血清培养液中的转染效率下降最少，所以最终选择了HPγ-CD-PEI 600进行第二部分试验。比较共聚物的不同组成和转基因效率的关系，认为PEI的接入量与共聚物缩合DNA的能力和转基因的效率有直接的关系。新的共聚物中PEI的接入量高，共聚物缩合DNA的能力强，转基因的效率也较高。第二部分提高新型载体靶向Her-2受体阳性细胞的能力目的：将新型载体HPγ-CD-PEI 600与靶向寡肽偶联，使其具有靶向到Her-2受体阳性的乳腺肿瘤或卵巢肿瘤细胞的能力。方法：根据文献报道的通过噬菌体展示技术筛选出来，针对Her-2受体蛋白的一段高亲和力寡肽（序列为MARAKE）做为配体通过试剂SPDP偶联新型载体HPγ-CD-PEI 600。质子核磁共振波谱法验证寡肽与新型载体的偶联。偶联寡肽的载体携带绿色荧光蛋白质粒及荧光素酶质粒转染Her-2受体阳性细胞（卵巢癌SKOV-3c细胞，乳腺癌SK-BR-3细胞和T 47D细胞）和Her-2受体阴性细胞（乳腺癌MCF-7细胞），用流式细胞仪检测具有绿色荧光细胞百分率，化学发光仪检测荧光素酶相对荧光强度，比较偶联寡肽后与未偶联寡肽载体的转基因效率。通过自由寡肽的阻断来比较偶联寡肽的新型载体与未偶联寡肽载体的转染效率。体内试验使用SKOV-3c细胞接种裸鼠成瘤，然后使用偶联寡肽的新型载体携带α-干扰素的真核表达质粒进行瘤内注射，观察肿瘤生长情况及裸鼠的生存期。结果：在质子核磁共振波谱法检测合成产物后，证实载体与靶向性的寡肽偶联。分别使用偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600和未偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600携带绿色荧光蛋白质粒及荧光素酶质粒转染不同的Her-2受体阳性细胞，检测发现，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600和未偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600相比，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在卵巢癌SKOV-3c细胞转染后绿色荧光细胞百分率提高了87％，荧光素酶检测的相对荧光强度提高了63％；偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在SK-BR-3细胞转染后绿色荧光细胞百分率提高了58％，相对荧光强度提高了77％；偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在T 47D细相对荧光强度提高了71％。偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在Her-2受体阴性细胞（乳腺癌MCF-7细胞）的转基因效率没有提高。自由寡肽抑制试验的结果显示在自由寡肽存在的情况下，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600并没有明显提高在Her-2受体阳性细胞转基因效率。在荷瘤裸鼠使用新型非病毒载体携带α-干扰素质粒瘤内注射治疗效果表明新构建的载体具有比PEI 25 k Da更好的治疗效果，治疗后裸鼠肿瘤生长受到了较为显著的抑制，偶联靶向寡肽的载体治疗组的小鼠肿瘤生长抑制最为明显。偶联靶向寡肽载体治疗组的荷瘤裸鼠生存期明显延长。讨论：新型载体易于偶联新的功能性的基团，新构建的载体通过与靶向寡肽MARAKE偶联后，可以提高对Her-2阳性肿瘤细胞基因效率。偶联寡肽的载体具备了对Her-2阳性肿瘤细胞的靶向性。新型非病毒载体携带α-干扰素质粒治疗荷瘤裸鼠效果结果显示了偶联寡肽的新型载体具有较好的体内应用前景。结论与展望：本研究选择多羟基的环糊精衍生物作为骨架，通过CDI这个试剂，与低分子量PEI进行偶联形成新的共聚物。CDI是可以将具有羟基的化合物和具有氨基的化合物进行连接的试剂，并且连接在两个化合物之间的酯键可以降解。在合成的共聚物中筛选到了有较强缩合DNA的能力的，转基因效率较高的新型转基因载体。通过比较共聚物的不同组成和转基因效率的关系，认为PEI的接入量与共聚物缩合DNA的能力和转基因的效率有直接的关系。新的共聚物中PEI的接入量高，共聚物缩合DNA的能力强，转基因的效率也较高。新的共聚物的优点还在于其容易进行进一步改造，引入合适的靶向物，提高靶向能力。新型转基因载体设计的新思路在试验中证实了可行性，而且通过靶向基团的引入可以获得具有靶向特异细胞或组织能力的高转基因效率的载体。由于环糊精自身有疏水性的空穴，可以包合药物，今后还可以应用于包合治疗药物，从而同时携带治疗基因和药物，提高治疗效果。