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背景与目的：Gitelman综合征(GS)由SLC12A3基因突变导致其编码的肾脏远曲小管钠氯协同转运蛋白(NCC)功能失活,是一种遗传性失盐性肾病,临床表现为低血钾、低血镁、代谢性碱中毒、低尿钙和肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮系统(RAAS)活化,但血压正常。目前临床上尚缺乏简单易行的诊断方法,限制了该病诊治水平的提高。本研究拟建立GS患者临床、基因和生理功能(氢氯噻嗪试验)诊断方法,结合体外基因突变功能试验,验证中国人群GS患者的常见和部分新突变的致病性；观察GS患者正常血镁亚型和糖耐量低减的表型。观察GS患者全身和局部RAAS活化及可能机制,探讨维生素D及其类似物抑制肾素的作用。方法：1.制定临床症状标准问卷、收集病例资料,提取外周血DNA,行SLC12A3基因外显子直接测序,氢氯噻嗪实验评估患者NCC蛋白功能状态。总结中国人高频和新发突变,构建野生型和突变型NCC质粒,体外转录成cRNA并进行显微注射,用爪蟾卵母细胞表达体系定量验证新突变功能。2.检测GS患者血、尿电解质水平(对照组为64位健康受试者)。行3h OGTT实验结果评价GS患者的胰岛素敏感性和胰岛分泌功能,对照组为健康受试者(n=20)和糖尿病患者(n=20)。3.分析低镁血症和正常血镁GS患者的临床特点、NCC功能试验差异,免疫组化法检测肾活检组织镁离子转运蛋白--瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员6(TRPM6)表达水平。4.RAAS卧立位实验测定GS患者全身血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平,免疫组化和荧光双染观察GS患者和胚胎肾组织中肾素产生细胞再募集现象。5.急性和慢性注射VDR激动剂,观察血浆肾素活性、肾组织肾素mRNA和蛋白的变化,观察VDR基因敲除小鼠肾素、环氧酶2(COX2)、NCC和TRPM6水平。体外实验观察VDR是否在球旁器颗粒细胞(JG)或致密斑(MD)细胞表达,并探究活性维生素D对低氯诱导的MD细胞COX2高表达的影响。结果：1.60位确诊的GS患者常见的临床表现为肌无力(79.7%)、乏力(55.9%)、手足痉挛或抽搐(45.8%)、心悸(40.7%)、感觉异常(35.6%)和夜尿增多(33.9%),且男性GS患者的临床表现较女性患者重。2.54种突变中含14种新突变,中国GS患者突变频率高于5%的突变为T60M.D486N和R913Q。体外功能实验证明突变型NCC(T60M, L215F, D486N, N534K, Q617R和R928C)摄取22Na+的能力均显著低于野生型,且突变型NCC转运活性的下降是由转运子特异性突变所致。3.建立了简化氢氯噻嗪实验诊断方法,确定了中国人群正常值范围,用于临床证实GS患者NCC蛋白功能受损。使用氢氯噻嗪前后氯排泄分数净增加值来诊断GS的ROC曲线下面积为0.983,取2.86作为截点,以基因诊断为金标准,该实验诊断低钾、碱中毒GS患者的灵敏度为95%,特异度为95.2%。4. OGTT实验结果提示GS患者存在糖代谢和胰岛素功能异常,与健康对照相比,GS患者表现为血糖和胰岛素分泌高峰延迟,血糖曲线下面积增加,胰岛素分泌敏感性指数(ISSI)降低,而胰岛素敏感性指标(ISOGTT、QUICKI 和 HOMA-IR)无显著差异。5.正常血镁患者临床表现较低镁血症患者轻,对氢氯噻嗪的反应好于低镁血症患者。NCC和TRPM6同时表达在肾脏远曲小管。正常血镁患者(n=2)远曲小管TRPM6表达水平与轻微病变对照组(n=14)无显著差异(7.82±5.23%vs.8.63±2.67%,p>0.05),而低镁血症GS患者(n=10)TRPM6表达水平显著低于对照组(4.96±1.88%vs.8.63±2.67%, p=0.001)。6.88%的GS患者存在全身RAAS活化,GS患者(n=18)肾组织球旁器增生,肾素表达水平显著高于轻微病变对照组,球旁器和微动脉区域均发现了肾素与α-Actin共表达现象,重现了胚胎阶段肾组织的情况。7.活性维生素D及其类似物均不能抑制急性肾素分泌,但腹腔注射两周其类似物--RO化合物可抑制肾素mRNA表达,且不升高血钙。VDR基因敲除小鼠血钙降低,肾素mRNA表达增加2.9倍。MD细胞表达VDR,活性维生素D不能抑制低氯诱导的MD细胞COX2高表达。结论：建立了GS临床、基因和生理功能试验(氢氯噻嗪试验)诊断模型。氢氯噻嗪实验是一种简单、经济、可靠的GS诊断和鉴别诊断方法。新发现了14种突变,明确了中国GS患者的高频突变包括T60M、D486N和R913Q。男性GS临床表现更重,部分患者存在糖耐量低减和胰岛素分泌功能异常。正常血镁是GS的一种亚型,血镁水平与GS患者临床严重程度及NCC功能相关,TRPM6蛋白表达减少可能是导致GS患者低镁血症的重要原因。GS患者RAAS活化的结构基础是肾素产生细胞再募集,新型活性维生素D类似物—RO化合物可抑制肾素活性,有潜在治疗GS的价值。