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恶性肿瘤的中医“伏毒”学说认为,“伏毒”是潜藏于人体的致病邪毒,在手术、放化疗等治疗手段后仍残余存在,具有伏而不觉、发时始显的病理特性,有较强的沿气血通道播散的能力,发病则毒性猛烈、病情危重或迁延难祛。这与现代医学的肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)导致恶性肿瘤转移的认识非常相似。加之既往研究表明,血小板可促进肿瘤细胞的血行转移。那么我们有理由设想,肿瘤干细胞作为肿瘤转移的起源,与普通肿瘤细胞相比,是否有更强的活化血小板、逃避免疫监视从而促进肿瘤血行转移的作用。因此本研究受中医“伏毒”学说启发,拟从肿瘤干细胞和血小板包被、免疫逃逸的角度探索肿瘤转移的机制,并观察基于中医“伏毒”学说的“扶正祛毒方”(reinforce the healthy qi and dispel toxin formula, RHDT)对 4T1细胞系干细胞(4T1-CSCs)活化血小板、逃避免疫监视的干预作用,为扶正祛毒方防治肿瘤转移提供实验依据,为中医药特异性靶向调控肿瘤干细胞提供理论依据。研究目的1.明确乳腺癌干细胞高效表达组织因子,诱导血小板活化,逃避免疫监视而转移的机制；2.探索扶正祛毒方对乳腺癌干细胞基于组织因子而活化血小板逃避免疫监视的调控作用。研究方法1.采用乳腺癌4T1细胞系,通过悬浮球状培养法分离富集、培养纯化出乳腺癌干细胞微球(Tumor Spheres),并用流式细胞仪鉴定其干细胞表型。将4T1或4T1-CSCs分别与水洗血小板在血小板聚集仪的剪切力下相互作用,通过免疫荧光法分析4T1或4T1-CSCs与血小板的黏附情况：通过流式细胞仪检测血小板表面活化标志物CD62p的表达,以及用ELISA法检测血小板经4T1或4T1-CSCs诱导活化后释放TGF-β1的含量,观察4T1或4T-CSCs诱导血小板活化的情况。再将血小板经4T1或4T-CSCs诱导活化后产生的上清加入小鼠脾脏NK细胞中孵育,通过流式细胞仪检测NK细胞CD107a和NKG2D受体的表达,比较血小板经4T1或4T-CSCs诱导活化后产生的不同上清对NK细胞的抑制作用。然后通过Western-Blot法比较4T1及4T1-CSCs表面组织因子表达的差异。2.通过CCK8法观察扶正祛毒方在不同浓度、不同时间点对4T1或4T1-CSCs细胞增殖的影响。将扶正祛毒方干预后的4T1或4T1-CSCs与水洗血小板在血小板聚集仪中作用,通过流式细胞仪检测及ELISA法,观察扶正祛毒方对4T1或4T1-CSCs活化血小板作用的影响。再将血小板经药物干预后的4T1或4T1-CSCs诱导活化后,产生的上清加入NK细胞中孵育,通过流式细胞术观察扶正祛毒方干预后的细胞诱导的活化血小板上清对NK细胞抑制作用的变化。然后通过Western-Blot法检测药物干预后的4T1或4T1-CSCs表面组织因子含量的差异。研究结果1.接种于无血清培养基中的对数生长期4T1细胞可形成Tumor Spheres,三代以上相对纯化,流式细胞术鉴定其高表达乳腺癌干细胞表型CD24-/lowCD44+。通过免疫荧光分析可见,无论是4T1还是4T1-CSCs,其表面都包被了大量血小板,形成一层保护膜围绕在肿瘤细胞表面,甚至将肿瘤细胞连接成团、成片。2.流式细胞仪结果显示,未加激活剂的单纯血小板组CD61+CD62p+细胞仅占(3.467±0.603)%,4T1活化血小板组、4T1-CSCs活化血小板组的CD61+CD62p+细胞比例都高于胶原活化血小板组(P<0.01),且4T1-CSCs活化血小板组明显高于4T1活化血小板组(P<0.01)。3.流式细胞仪结果显示,单纯NK细胞组CD107a自发荧光较少,4T1或4T1-CSCs活化血小板上清作用于NK后,都使NK细胞CD107a表达明显下降(P<0.01)。且4T1-CSCs活化血小板上清组的NK杀伤活性抑制率明显高于4T1活化血小板上清组(P<0.05)。4.流式细胞仪结果显示,4T1活化血小板上清组NKG2D的特异荧光指数水平(specific fluorescence index, SF I)明显低于单纯NK细胞组(P<0.05),4T1-CSCs活化血小板上清组也明显低于单纯NK细胞组(P<0.01)。虽然4T1活化血小板上清组和4T1-CSCs活化血小板上清组NKG2D的SFI没有明显统计学差异(P>0.05),但在数据上看后者有小于前者的趋势。5.ELISA法检测结果显示,4T1活化血小板组的TGF-β1含量高于胶原活化血小板组(P<0.05),而4T1-CSCs活化血小板组也高于胶原活化血小板组(P<0.01),且4T1-CSCs活化血小板组明显高于4T1活化血小板组(P<0.01)。6. Western-Blot检测结果显示,4T1-CSCs表面组织因子(tissue factor, TF)蛋白含量高于4T1细胞(P<0.05)。7.CCK8检测结果显示,48h扶正祛毒方干预4T1-CSCs的IC50为13.55 mg/ml,干预4T1的IC50为10.4mg/ml;48h可司匹林(Asprin)干预4T1-CSCs的IC50为3.469mM,干预4T1的IC50为1.768mM。8.药物干预后,流式细胞仪血小板活化率(CD61+CD62p+%)结果显示,较之4T1活化血小板组,Asprin干预的4T1活化血小板组和RHDT干预的4T1活化血小板组的血小板活化率均明显下降(P<0.01),而Asprin干预组和RHDT干预组统计无明显差异(P>0.05)；较之4T1-CSCs活化血小板组,Asprin干预的4T1-CSCs活化血小板组和RHDT干预的4T1-CSCs活化血小板组的血小板活化率均明显减小(P<0.01)，而Asprin干预组和RHDT干预组无统计学差异(P>0.05)。ELISA法检测TGF-β1含量结果显示,较之4T1活化血小板组,Asprin干预的4T1活化血小板组和RHDT干预的4T1活化血小板组的含量均明显减少(P<0.01)；较之4T1-CSCs活化血小板组,Asprin干预的4T1-CSCs活化血小板组的含量明显下降(P<0.01),RHDT干预的4T1-CSCs活化血小板组的含量也明显减少(P<0.05)。9.药物干预后,流式细胞仪NK杀伤活性抑制率结果显示,与4T1活化血小板上清组比较,Asprin干预的4T1活化血小板上清组和RHDT干预的4T1活化血小板上清组抑制率均明显减低(P<0.01),且RHDT干预组比Asprin干预组更低(P<0.01)；与4T1-CSCs活化血小板上清组比较,Asprin干预的4T1-CSCs活化血小板上清组和RHDT干预的4T1-CSCs活化血小板上清组抑制率均明显减低(P<0.01),而RHDT干预组与A sprin干预组没有统计学差异(P>0.05)。流式细胞仪NKG2D的SFI结果显示,Asprin干预的4T1活化血小板上清组与4T1活化血小板上清组SFI没有统计学差异(P>0.05)但有大于后者的趋势,RHDT干预的4T1活化血小板上清组明显大于4T1活化血小板上清组(P<0.05)；Asprin干预的4T1-CSCs活化血小板上清组明显大于4T1-CSCs活化血小板上清组(P<0.05),RHDT干预的4T1-CSCs活化血小板上清组与4T1-CSCs活化血小板上清组没有统计学差异(P>0.05)但有大于后者的趋势。10.药物干预后,Western-Blot检测细胞TF蛋白含量结果显示,Asprin干预的4T1-CSCs组和RHDT干预的4T1-CSCs组均较4T1-CSCs组明显下降(P<0.01); Asprin干预的4T1组较4T1组含量下降(P<0.05), RHDT干预的4T1组(4T1+RHDT组)与4T1组无明显统计学差异(P>0.05),但前者较后者有下降的趋势。结论1.4T1和4T1-CSCs都能作为血小板激活剂诱导血小板的黏附聚集和活化,其表面有大量活化血小板包被,且4T1-CSCs较4T1有更强的活化血小板的能力。2.血小板经4T1-CSCs诱导活化后释放于上清的物质较之4T1有更强的抑制NK细胞杀伤活性的作用,且二者都能显著抑制NK细胞NKG2D的表达。3.较之4T1,4T1-CSCs有更强的诱导血小板活化释放T GF-β1的能力,这可能与4T1-CSCs更强的抑制NK细胞作用有关。4.4T1-CSCs较4T1细胞表面表达更多TF,这可能与4T1-CSCs更强的黏附聚集、诱导活化血小板的能力有关。5.扶正祛毒方及对照药阿司匹林都对4T1或4T1-CSCs的生长有抑制作用,且呈时间剂量依赖性。6.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs诱导的血小板活化及血小板释放TGF-β1。7.扶正祛毒方可以减轻4T1或4T1-CSCs活化血小板上清对NK细胞杀伤活性的抑制作用；使4T1活化血小板上清对NK细胞NKG2D的抑制作用减弱,没有影响4T1-CSCs活化血小板上清对NKG2D的作用。8.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs诱导的血小板活化以及血小板释放TGF-β1,并且进一步减轻对NK细胞的抑制,可能是源于扶正祛毒方减少了4T1或4T1-CSCs细胞表面的TF表达。