苗药小花清风藤鉴定学研究

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目的:本文以贵州苗药小花清风藤及其同属近缘种药用植物作为研究对象,通过查阅整理相关文献资料和野外考察、样本采集,从药材性状、显微结构、薄层色谱、DNA条形码、近红外光谱等方面入手,对该植物类群及其药材进行鉴定学研究。掌握小花清风藤与近缘种药用植物的性状、显微、理化及分子鉴别特征和鉴定方法。预期研究成果不但可为小花清风藤的开发利用提供强有力的智力支持,推进贵州民族药这一特色支柱产业的可持续健康发展,还可为中药材的真伪鉴定和品质评价提供新的思路与方法,无论是在学术研究,还是社会效益等方面均具有重要意义。  方法:(1)通过对小花清风藤与近缘种8个物种84份样品的ITS、ITS2、matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列的PCR扩增和测序,对小花清风藤及其近缘种药用植物的种内和种间变异、鉴定效率进行分析。对经初筛后的候选序列进行Wilcoxon秩和检验、Barcoding gap检验以及NJ建树聚类分析并评估其鉴定能力。(2)利用近红外光谱技术对小花清风藤及其近缘种药用植物进行无损鉴定研究,通过采集供试样品的近红外光谱信息,采用二阶导数、标准正态变量变换和多元散射校正等方法,对样品的原始谱图及数据进行处理,计算近红外光谱相似度,绘制各药用部位的聚类分析树状图,探究小花清风藤及其近缘种药用植物的种内和种间差异。(3)应用数码显微摄影和SPSS22.0软件对小花清风藤与近缘种老茎石细胞特征进行观察、测量和统计分析。(4)应用数码摄影、Photoshop CS3软件和SPSS22.0软件对小花清风藤及其近缘种药用植物老茎的横切面特征进行拍摄、测量和统计分析。(5)根据文献报道,黄酮类成分是清风藤属药用植物的主要活性成分之一,故以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶2.5∶1)为展开剂,对小花清风藤及近缘种药用植物的叶、一年生茎、老茎进行薄层色谱鉴别研究。  结果:(1)DNA条形码研究结果表明,ITS2、matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列的PCR扩增成功率除ITS外,其余均为100%,测序成功率,psb K-psbI为100%,其次是ITS2为98.8%,psbA-trnH为97.62%,ITS为88.75%,matK为88.10%;barcoding gap分析结果显示ITS2序列形成了较明显的gap区域优于其他序列,其余序列种内和种间遗传距离值重叠较多,没有形成明显的间隔。基于ITS2构建的NJ系统树结果表明,小花清风藤与其近缘种都能够单独聚成一支,自展支持率较高,基本能对小花清风藤及其各近缘种间进行有效的区分。(2)近红外鉴定研究结果显示,小花清风藤叶的种内近红外光谱相似度达到91.84%,而与其他近缘种的种间NIRS相似度只有64.03%,近红外光谱相似度值差异明显,表明叶的近红外光谱相似度差异明显,可以作为小花清风藤与其他近缘种分类的鉴别依据。但其一年生茎和老茎与其他物种间差异不大,不能作为该类药材鉴别的有效参考依据;药材叶部分的系统聚类分析结果表明,小花清风藤有很好的聚集度,与其他近缘种可以有效的区分。(3)所观察的7种植物老茎中石细胞的形态、大小、纹孔等显微特征存在一定差异,其中石细胞长度和宽度的差异较为显著,而长宽比值差异并不明显。(4)所观察的5种植物老茎横切面中髓/木部比值、髓射线数目等数值存在着一定差异,可以有效的将各物种区分开来。(5)薄层色谱结果显示在紫外灯(365nm)下小花清风藤各斑点清晰可见,与其他近缘种有明显差异,能够有效鉴别小花清风藤药材。  结论:通过DNA条形码的筛选结果表明,ITS2序列可作为小花清风藤及其近缘种药用植物DNA条形码鉴定的推荐序列,不仅为小花清风藤及其近缘种药用植物找到了一种快速、准确、高效的鉴别方法,通过其NJ系统树的构建,对探讨该属药用植物种间亲缘关系和演化规律具有重要意义;建立的近红外鉴定方法,为鉴别小花清风藤及其近缘种药用植物提供了新的思路,以及探究其种间和不同药用部位的化学成分差异具有一定的参考价值;本文研究结果表明,小花清风藤及其近缘种药用植物的横切面性状特征、石细胞显微特征等在近缘种间和易混品间存在一定差异,对该类植物和药材的分类鉴定,以及探究种间亲缘关系具有参考价值;建立的小花清风藤及其近缘种药用植物薄层色谱鉴定方法可作为物种鉴别的参考依据。
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