结核病是由结核杆菌引起的一种传染病,全世界约有 20 亿人感染过结核杆菌,每年约有200~300万人死于结核病。当前唯一可用的疫苗--卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)的免疫效果下降,对其保护效果也存在争议,经试验证明其总有效率仅为50%。而且对成年人的免疫效果也不明确,因此现在急需研制出新型疫苗。国内外学者在结核DNA疫苗方面进行了一系列的研究,其中Ag85A作为靶抗原取得了一定的效果,但以其作为DNA疫苗的靶抗原,仍需要一定的改进。近年研究发现,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)由多种细胞分泌,能够刺激和活化专业APC,提高体液免疫和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)应答,因而是基因免疫极有运用前景的细胞因子。本研究将GM-CSF编码基因与目的基因构建于同一载体上,依靠GM-CSF的免疫佐剂作用,提高Ag85A基因的免疫效果。本实验成功构建了结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达载体,然后免疫小鼠,观察共表达质粒的免疫效果,为结核杆菌DNA疫苗的研制提供一种新的思路和方法。本实验分为两个部分:一、结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达载体的构建、鉴定与蛋白表达目的:构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达质粒,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A,用PCR方法从pc-GM-CSF质粒中扩增出GM-CSF,构建于pI85A质粒上,成为共同表达质粒pI85AGM。然后转染7721细胞(肝癌细胞),进行蛋白的表达和鉴定。结果:经酶切鉴定和DNA测序证实共同表达载体构建正确。通过RT-PCR、<WP=5>SDS-PAGE、Western-blotting检测证实Ag85A与GM-CSF基因的转录和蛋白表达正确。结论:细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功,为研制新型结核杆菌DNA疫苗在动物体内免疫效应的研究奠定了基础。二、结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达载体对小鼠的免疫效果目的:研究结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达质粒对小鼠的免疫效果,为设计新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的思路。方法:将重组质粒免疫小鼠,通过CTL和NK细胞杀伤活性和特异性淋巴细胞增殖试验,以及小鼠血清抗体的检测,考察结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF对小鼠的免疫效果。结果:共同表达载体Ag85A与GM-CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强、特异性淋巴细胞明显增殖,NK细胞杀伤活性与对照组相比有一定提高,但未超过GM-CSF单独免疫效果。可引起小鼠血清特异性抗体产生,但滴度较低。结论:细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功,对小鼠有一定的免疫效果,为进一步在动物体内进行保护性效应试验研究提供了条件。