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酚氧化酶（phenoloxidase，EC.1.14.18.1，简称PO）是一种重要的酶类，广泛存在于无脊椎动物、脊椎动物、植物、细菌和真菌等生物体内，在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要作用，主要功能可总结为：（1）参与表皮的硬化和黑化；（2）对卵壳的鞣化作用；（3）参与伤害防御；（4）加速伤口的愈合等，是一种潜在的靶标酶。本文通过RT-PCR和RACE技术，克隆得到了编码菜青虫（Pieris rapae）酚氧化酶原的两个基因Prophenoloxidase-1（PrPPO1）和Prophenoloxidase-2（PrPPO2），并对序列信息进行了分析；并通过Semi-Quantitative RT-PCR和QuantitativeReal-time PCR研究了PPO1和PPO2在菜青虫不同发育时期的表达情况；并用白僵菌制剂注射菜青虫5龄幼虫，研究白僵菌分生孢子对菜青虫PPO转录活性的影响，同时使用两种典型的PO抑制剂——槲皮素和曲酸，对菜青虫5龄幼虫进行了处理，测定了处理后4h、8h和12h时PPO1的表达情况。研究结果如下：1. PrPPO1全长cDNA序列有3338bp，包含一个2049bp的开放阅读框（ORF），一个63bp的5’非编码区（5’UTR）和一个1226bp的带有加尾信号的3’非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第64个核苷酸开始，终止于第2102个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为682个氨基酸，分子量为78.57kDa，估测等电点pI为6.37。2. PrPPO2部分cDNA序列有1679bp，包含一个1173bp的开放阅读框（ORF）和一个506bp的带有加尾信号的3’非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第1个核苷酸开始，终止于第1173个核苷酸，由于该片段为部分cDNA，其他相关参数不做预测。3. PrPPO1基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPOl基因具有较高的同源性（69.73%~73.15%）；PrPPO2基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPO2基因具有较高的同源性（70.0%~72.0%）。4. PrPPO1和PrPPO2各均具有两个高度保守的铜离子结合位点，及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基，此外，PrPPO1还包含一个类似于脊椎动物的α-巨球蛋白的硫羟酸酯区域。PrPPO1与PrPPO2的N端均不含信号肽，不存在跨膜结构域。5. PrPPO1中，α-螺旋占17.16%，随机卷曲63.20%，它们是PrPPO1最大量的结构元件，延伸链占19.65%，散布在整个蛋白质中，无β转角存在，同源建模显示PrPPO1三级结构均为“α/β型”中的“滚筒结构”。6. PrPPO1在成虫中的表达量设定为1.0，PrPPO1在卵和4龄幼虫中表达量最高，表达量分别为2.76和5.60；PrPPO1在5龄幼虫和蛹中表达量较低，为0.21和0.26；在1龄、2龄、3龄幼虫中，PrPPO1的表达量比较接近，分别为2.16、1.82和1.52。PrPPO2在成虫中的表达量设定为1.0，PrPPO2在4龄幼虫中表达量最高，表达量为13.24；卵和3龄幼虫次之；PrPPO2在5龄幼虫中表达量较低，为0.96；在1龄和2龄幼虫中，PrPPO1的表达量比较接近，分别为2.98和2.65；预蛹和蛹比较接近，分别为1.91和1.42。通过Real-time PCR和RT-PCR比较PrPPO表达量变化结果非常相近。7.白僵菌接种试验中，侵染组和对照组（PBS）在6h-12h之间PrPPO1的表达量均有大幅度的升高，在12h的表达量分别为6h的5.67倍和5.0倍。而在12h后直至24h，PrPPO1的表达水平开始回落，且在整个实验过程中侵染组和对照组（PBS）PrPPO1的表达水平差距不明显，说明白僵菌侵染菜青虫对PPO影响甚微。8.在不同浓度的槲皮素和曲酸注射菜青虫的条件下，PrPPO1的转录活性抑制不明显。