具有抑菌活性土壤拮抗放线菌C3-11菌株的筛选研究

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本文采用高氏一号培养基从贵州、重庆、河南和云南等省份的土样中分离纯化出200株放线菌菌株,采用抑制菌丝生长速率法对其发酵液进行了活性菌株的筛选研究。共筛选出5株活性较好的放线菌菌株作为候选菌株,主要研究结果如下:  (1)采用稀释法对采自贵州、重庆、河南、云南等省份的土样进行菌株的分离纯化,共纯化出200株菌株。对纯化出的菌株进行摇瓶发酵,以小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为指示菌用抑制菌丝生长速率法对200株菌株的发酵液进行室内生物活性初筛,筛选结果表明,共发现5株活性较好的放线菌菌株,它们依次是C3-2、C3-4、C3-11、N-7和N-10。这5株放线菌的发酵液对油菜菌核病菌的抑制率均达到85%以上,说明抑菌效果较好。  (2)对C3-2、C3-4、C3-11、N-7和N-10菌株的发酵液进行室内抑菌谱的测定。抑制菌丝生长速率法生测结果表明,5株放线菌的发酵液对12种病原真菌均有一定的抑制作用,对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制率都达到了80%以上,C3-2、C3-4、C3-11菌株发酵液对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、交链孢病菌(Alternaria alternate)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、半夏立枯病菌(Rhizoctonia solani)和莴苣黑斑病菌(Stemphylium chisha)的抑制率均达到了50%以上。其中C3-11菌株发酵液的抑菌效果最好。故以下研究重点以C3-11菌株为主要候选菌株。管蝶法对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)三种病原细菌测定结果显示,5株放线菌菌株的发酵液均无明显的抑制细菌的作用。  (3)菌株分子生物学鉴定表明,C3-11菌株属于链霉菌属。16S rDNA序列分析证明C3-11菌株与链霉菌中的龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的核苷酸有99%的同源性;经典分类法鉴定发现,C3-11菌株在培养特征和生理生化特性方面与龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)存在一定的差异,推断C3-11菌株可能是龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的一个近缘种,暂定名为Streptomyces sp. C3-11。(4)以油菜菌核病菌为指示菌,对C3-11菌株的发酵液进行稳定性稳定性研究以及发酵条件的初步优化。稳定性研究结果表明C3-11菌株发酵液对光照、温度及酸都有良好的稳定性,自然光照60 d抑菌活性为93.6%、80°C处理1 h抑菌活性依然保持在87.8%、在pH2-6的1 mol/L的HCl溶液中处理后与原始发酵液相比均无明显变化;但对碱的稳定性稍差一些,当pH为12时抑菌活性仅为60.8%。对C3-11菌株发酵条件初步优化结果表明菌株的最适发酵条件为种子发酵2 d后,以10%接种量接入pH为7的装有100 mL小米液体发酵培养基的250 mL三角瓶中,发酵5-6 d,发酵液的抑菌活性最好。  (5)对 C3-11的发酵产物进行分离条件的初步研究,萃取结果表明此菌株发酵液的极性较大,大孔树脂静态吸附实验结果表明,ADS-17吸附解析效果都不佳;AB-8容易吸附,但不易解析;D101吸附解析效果相对较好。  (6)通过萃取、大孔树脂吸附和重结晶等手段对 GLP-26菌株发酵液进行进一步的分离尝试,获得一白色针状晶体。
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