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目的：
观察肿瘤浸润性CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1(programmed death1,PD-1)的表达水平，探讨SNX25（sorting nexin25，SNX25）在肿瘤浸润性CD8+T细胞中分拣PD-1进入外泌体（exosomes）的能力以及其对CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的作用。
方法：
（1）采用免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞，流式细胞术（FCM）鉴定细胞纯度。利用流式细胞术和Western-blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞中PD-1的表达情况。将小鼠CT26结肠癌细胞培养上清（tumor cell conditioned medium，TCCM）加入小鼠脾脏来源CD8+T细胞培养孔中，检测细胞表面PD-1表达的变化情况。
（2）免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞（WT-sp-CD8）、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞（TU-sp-CD8）以及荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞（TIL-CD8），分别接种在预包被1?g/mL抗小鼠CD3、CD28抗体的24孔板中，37℃、5%CO2培养24h，收集培养上清，分别提取不同CD8+T细胞来源的exosomes。透射电子显微镜观察CD8+T细胞来源的exosomes的形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测exosomes粒径分布，Western blot检测exosomes相关蛋白及PD-1的表达，FCM检测exosomes表面分子。检测经TCCM处理的野生型小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes中PD-1的表达情况。
（3）Western blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞中SNX25的表达。采用蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测CD8+T细胞中PD-1与SNX25是否相互结合，进一步观察WT-sp-CD8、TU-sp-CD8和TIL-CD8中两者结合情况的变化。CD8+T细胞经TCCM处理，Western blot检测细胞中SNX25的表达变化，以及PD-1与SNX25的结合的变化情况。
（4）利用免疫荧光技术观察CD8+T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）的定位，了解SNX25在exosomal PD-1分拣中的可能作用。
（5）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用，采用小鼠SNX25特异性siRNA敲减野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞中的SNX25后，FCM检测CD8+T细胞表面分子PD-1的表达，Western blot检测CD8+T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。
（6）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用，采用慢病毒过表达SNX25后，FCM检测CD8+T细胞表面分子PD-1的表达，Western blot检测CD8+T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。
结果：
（1）免疫磁珠法分选的小鼠脾脏和肿瘤组织来源的CD8+T细胞纯度均超过90%以上。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞相比，肿瘤浸润性CD8+T细胞表面PD-1异常高表达。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞表面PD-1的MFI值在第2天达到峰值为23826±2153.6，而对照组PD-1的MFI值为2731±226.27。
（2）在透射电子显微镜下CD8+T细胞来源exosomes呈圆形或椭圆形茶托样结构，exosomes直径主要分布在100nm左右，Western blot检测发现其表达CD63、Hsp70等特征性分子，不表达Calnexin分子，流式检测发现exosomes表面表达CD8、CD25以及PD-1等分子。且发现肿瘤浸润性CD8+T细胞来源exosomes中PD-1的含量较野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes减少。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes中的PD-1明显减少。
（3）Co-IP检测发现CD8+T细胞中PD-1与SNX25相互结合。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞相比，肿瘤组织来源CD8+T细胞中PD-1与SNX25结合减少。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中PD-1与SNX25结合减少。
（4）CD8+T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）结合。
（5）敲减野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中的SNX25后，CD8+T细胞分泌的exosomes中PD-1含量下降，而CD8+T细胞表面PD-1的表达上调。
（6）过表达野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中的SNX25后，CD8+T细胞分泌的exosomes中PD-1含量增加，而CD8+T细胞表面PD-1的表达下调。
结论：
肿瘤浸润性CD8+T细胞中经SNX25分拣进入外泌体的PD-1分子减少，导致CD8+T细胞经exosomes途径向胞外环境释放的PD-1分子减少，从而使得CD8+T细胞表面的PD-1表达水平升高。
观察肿瘤浸润性CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1(programmed death1,PD-1)的表达水平，探讨SNX25（sorting nexin25，SNX25）在肿瘤浸润性CD8+T细胞中分拣PD-1进入外泌体（exosomes）的能力以及其对CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的作用。
方法：
（1）采用免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞，流式细胞术（FCM）鉴定细胞纯度。利用流式细胞术和Western-blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞中PD-1的表达情况。将小鼠CT26结肠癌细胞培养上清（tumor cell conditioned medium，TCCM）加入小鼠脾脏来源CD8+T细胞培养孔中，检测细胞表面PD-1表达的变化情况。
（2）免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞（WT-sp-CD8）、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞（TU-sp-CD8）以及荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞（TIL-CD8），分别接种在预包被1?g/mL抗小鼠CD3、CD28抗体的24孔板中，37℃、5%CO2培养24h，收集培养上清，分别提取不同CD8+T细胞来源的exosomes。透射电子显微镜观察CD8+T细胞来源的exosomes的形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测exosomes粒径分布，Western blot检测exosomes相关蛋白及PD-1的表达，FCM检测exosomes表面分子。检测经TCCM处理的野生型小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes中PD-1的表达情况。
（3）Western blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD8+T细胞中SNX25的表达。采用蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测CD8+T细胞中PD-1与SNX25是否相互结合，进一步观察WT-sp-CD8、TU-sp-CD8和TIL-CD8中两者结合情况的变化。CD8+T细胞经TCCM处理，Western blot检测细胞中SNX25的表达变化，以及PD-1与SNX25的结合的变化情况。
（4）利用免疫荧光技术观察CD8+T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）的定位，了解SNX25在exosomal PD-1分拣中的可能作用。
（5）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用，采用小鼠SNX25特异性siRNA敲减野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞中的SNX25后，FCM检测CD8+T细胞表面分子PD-1的表达，Western blot检测CD8+T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。
（6）为了探究SNX25在exosomal PD-1分拣中的作用，采用慢病毒过表达SNX25后，FCM检测CD8+T细胞表面分子PD-1的表达，Western blot检测CD8+T细胞来源外泌体中PD-1含量的变化。
结果：
（1）免疫磁珠法分选的小鼠脾脏和肿瘤组织来源的CD8+T细胞纯度均超过90%以上。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞相比，肿瘤浸润性CD8+T细胞表面PD-1异常高表达。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏来源CD8+T细胞表面PD-1的MFI值在第2天达到峰值为23826±2153.6，而对照组PD-1的MFI值为2731±226.27。
（2）在透射电子显微镜下CD8+T细胞来源exosomes呈圆形或椭圆形茶托样结构，exosomes直径主要分布在100nm左右，Western blot检测发现其表达CD63、Hsp70等特征性分子，不表达Calnexin分子，流式检测发现exosomes表面表达CD8、CD25以及PD-1等分子。且发现肿瘤浸润性CD8+T细胞来源exosomes中PD-1的含量较野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes减少。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏CD8+T细胞来源exosomes中的PD-1明显减少。
（3）Co-IP检测发现CD8+T细胞中PD-1与SNX25相互结合。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD8+T细胞相比，肿瘤组织来源CD8+T细胞中PD-1与SNX25结合减少。TCCM处理后，野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中PD-1与SNX25结合减少。
（4）CD8+T细胞中PD-1、SNX25与早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）结合。
（5）敲减野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中的SNX25后，CD8+T细胞分泌的exosomes中PD-1含量下降，而CD8+T细胞表面PD-1的表达上调。
（6）过表达野生型小鼠脾脏CD8+T细胞中的SNX25后，CD8+T细胞分泌的exosomes中PD-1含量增加，而CD8+T细胞表面PD-1的表达下调。
结论：
肿瘤浸润性CD8+T细胞中经SNX25分拣进入外泌体的PD-1分子减少，导致CD8+T细胞经exosomes途径向胞外环境释放的PD-1分子减少，从而使得CD8+T细胞表面的PD-1表达水平升高。