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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的危害家禽和野鸟的重要传染病,对全球养禽业造成重大经济损失。迄今为止,疫苗接种已被证明是控制新城疫流行的最有效方式。当前包括我国在内的多个国家均在家禽中广泛接种新城疫疫苗,其中I系苗Mukteswar曾作为紧急免疫疫苗被广泛应用。NDV作为RNA病毒,其聚合酶缺乏校正活性,同时在高水平免疫选择压力下,基因突变引起毒力增强的事件时有报道。本实验室前期在发病鸡中分离到一株NDV强毒株JS/7/05/Ch,全基因组测序结果表明与基因Ⅲ型中等毒力疫苗株Mukteswar高度同源,仅在NP和HN上分别有1和6个氨基酸位点差异;与Mukteswar相比,JS/7/05/Ch通过静脉接种途径感染后,对鸡致病性更强,但是通过滴鼻点眼途径（自然感染途径）感染后没有显著差异;确定了 HN蛋白氨基酸变异是导致NDV毒力差异的关键因素,然而其内在机制尚不清楚。为此,本研究系统性地分析了 HN蛋白突变对基因Ⅲ型NDV生物学特性的影响;鉴定了与不同来源HN蛋白差异互作的宿主蛋白,并进一步阐明了病毒感染与宿主蛋白间的相互影响;分析了基因Ⅲ型NDV经静脉接种途径介导的体内感染特性差异,旨在阐明不同毒力基因Ⅲ型NDV的感染机制。1.不同毒力基因Ⅲ型NDV的生物学特性研究Mukteswar和JS/7/05/Ch的HN蛋白存在6处氨基酸差异,结合NCBI上已公布的基因Ⅲ型NDV HN基因序列,我们发现Mukteswar来源的N19和A29与JS/7/05/Ch来源的T145、1266和D494为基因Ⅲ型NDVHN蛋白的优势氨基酸,而E495和K495各占一半比例,而这些氨基酸的变异改变了HN蛋白的三维结构。蛋白修饰结果显示,HN蛋白突变影响着NDV诱导的赖氨酸相关蛋白修饰水平,这提示着HN蛋白翻译后的功能可能存在差异。进一步研究发现HN蛋白突变影响着NDV生物学特性,主要表现为强毒株JS/7/05/Ch具备更强的受体结合活性、膜融合活性、溶血活性、F蛋白裂解活性以及噬斑形成能力,但其神经氨酸酶活性较弱;强毒株JS/7/05/Ch在HD11和PBMC细胞上均具备显著的复制优势,而在CEF细胞中仅在感染前期具有复制优势,感染后期的复制能力减弱,这可能与其诱导的高水平的细胞死亡有关。综上所述,本章节揭示了 HN蛋白突变对基因Ⅲ型NDV生物学特性的调控机制,有助于从病原学角度解释基因Ⅲ型NDV感染机制的差异。2.Vimentin与不同毒力基因Ⅲ型NDV HN的互作机制研究经质谱分析鉴定到一株骨架蛋白——波形蛋白（Vimentin）与不同毒力基因Ⅲ型NDV HN蛋白存在差异互作,表现为Mukteswar HN蛋白可与Vimentin互作,而JS/7/05/Ch HN蛋白不能,说明氨基酸的变异削弱了 JS/7/05/Ch HN蛋白与Vimentin的互作。在CEF细胞上,强毒株JS/7/05/Ch感染能显著下调Vimentin的表达水平,中等毒力株Mukteswar与替换JS/7/05/Ch HN基因的重组毒株JS/MukHN对Vimentin表达的影响不明显,而Vimentin对3株NDV的复制和吸附均起增强作用;强毒株JS/7/05/Ch感染CEF细胞后更早地引起Vimentin的重排,但在感染后期3株NDV均能显著诱导Vimentin的重排且在核周围发生聚集,无显著差异;另外CEF细胞Vimentin的重排区域未完全与病毒的复制重合,说明不是基因Ⅲ型NDV的病毒复制中心。在HD11细胞上,JS/7/05/Ch能够更显著地下调Vimentin的表达,而Mukteswar和JS/MukHN对Vimentin表达的影响较弱;HD11细胞中的Vimentin促进了 JS/7/05/Ch的吸附和复制,但对Mukteswar和JS/MukHN毒株无明显影响;JS/7/05/Ch感染HD11细胞后能快速诱导Vimentin发生重排并形成明显的“笼状”结构,且重排的Vimentin成为病毒复制中心,而Mukteswar和JS/MukHN的感染未能诱导Vimentin重排。此外在CEF和HD11细胞中,Vimentin的重排和病毒的复制均呈相互依赖的关系,即Vimentin重排的破坏会削弱病毒的复制,而病毒的失活则会阻碍Vimentin的重排。我们进一步对Vimentin生物学功能进行检测,发现强毒株JS/7/05/Ch诱导更强的细胞损伤、凋亡和自噬的水平,同时细胞凋亡和自噬对强毒株感染的影响也更显著;而Vimentin的敲低促进了 NDV诱导的细胞凋亡和自噬。值得注意的是,HN蛋白突变显著削弱了 JS/7/05/Ch对NF-κ1B的活化,这对病毒复制及其诱导的细胞活性、凋亡和自噬均起重要作用。综上所述,本章节鉴定了与不同毒力基因Ⅲ型NDV HN蛋白差异互作的宿主蛋白Vimentin,分析了 Vimentin与NDV感染间的差异互作,为进一步了解不同毒力基因Ⅲ型NDV的致病机制提供了重要线索。3.不同毒力基因Ⅲ型新城疫病毒的体内感染特性研究为了阐明HN蛋白突变影响基因Ⅲ型NDV对鸡致病性的内在机制,我们以携带差异HN蛋白的基因Ⅲ型NDV通过静脉注射途径感染SPF鸡,分析病毒体内感染特性的差异。与Mukteswar和JS/MukHN相比,强毒株JS/7/05/Ch感染鸡后导致更严重的临床症状和死亡率,排毒时间更早且比例更高,病毒经外周血高效复制后扩散至全身多个脏器从而造成严重的感染;JS/7/05/Ch具有更强的组织嗜性,主要引起肺脏和脾脏的炎性细胞浸润和胸腺的T淋巴细胞耗竭,且对体内脏器中的巨噬细胞亲嗜性更强,表现为病毒与肺脏、脾脏和胸腺的巨噬细胞存在明显的共定位。为了验证HN蛋白突变对NDV体内感染后Vimentin的影响,我们对不同组织中Vimentin及其相关功能蛋白进行了检测,结果发现JS/7/05/Ch在法氏囊、脾脏、胸腺和腺胃中显著下调Vimentin的表达水平,同时增强了法氏囊、胸腺和腺胃中自噬蛋白活化以及脾脏、胸腺和腺胃中凋亡蛋白活化,这与体外研究结果一致。此外,我们还通过转录组测序发现不同毒力基因Ⅲ型NDV感染后对宿主基因存在差异调控,其中差异表达的基因主要富集在细胞骨架和血液相关功能上,进一步佐证了基因Ⅲ型NDV在静脉接种后造成毒力差异以及与细胞骨架蛋白存在差异的互作。综上所述,本章节全面探讨了基因Ⅲ型NDV对鸡的致病性差异,揭示了 HN蛋白突变从多方面影响NDV的体内感染,进一步阐明了基因Ⅲ型NDV的毒力和致病性差异机制。