【摘 要】
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目的:原始睾丸位置靠近肾,后通过睾丸引带牵引逐渐降至阴囊,而环境雌激素可影响睾丸引带发育进而影响睾丸发育及下降。既往实验研究多集中于环境激素对睾丸引带细胞增殖及凋亡的影响,但较少对睾丸引带细胞的迁移进行探讨。事实上,睾丸下降的两个阶段,引带细胞的迁移活动都特别活跃。我团队前期研究成功证明己烯雌酚（Diethylstilbestrol,DES）作为环境雌激素可通影响小鼠睾丸引带细胞的细胞骨架重构和细
【基金项目】
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广东省自然科学基金（2020A1515010135,2018A030307045）；
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目的:原始睾丸位置靠近肾,后通过睾丸引带牵引逐渐降至阴囊,而环境雌激素可影响睾丸引带发育进而影响睾丸发育及下降。既往实验研究多集中于环境激素对睾丸引带细胞增殖及凋亡的影响,但较少对睾丸引带细胞的迁移进行探讨。事实上,睾丸下降的两个阶段,引带细胞的迁移活动都特别活跃。我团队前期研究成功证明己烯雌酚（Diethylstilbestrol,DES）作为环境雌激素可通影响小鼠睾丸引带细胞的细胞骨架重构和细胞发育进而影响睾丸下降。在其他非睾丸引带组织（角膜及结膜）及恶性肿瘤细胞中的相关实验已证明,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）能促进细胞迁移。那么DES是否通过调控MMP影响小鼠睾丸引带细胞迁移进而影响睾丸下降,目前尚未有人对此进行研究。本实验利用DES直接作用于体外培养的小鼠睾丸引带细胞,研究DES对小鼠睾丸引带细胞中MMP2和MMP14的表达变化及细胞迁移的影响,以探讨DES影响睾丸引带细胞迁移中MMP的作用及其可能的作用机理。材料与方法:将出生3d龄的雄性昆明小鼠剖出其睾丸引带组织并进行细胞培养。传代培养后取对数生长期细胞（约105/m1）,小鼠睾丸引带细胞随机分为实验组（加DES）、溶剂对照组（加DMSO）和空白对照组（加NS）,加药持续作用相同时间,用细胞免疫荧光技术检测各组细胞MMP2和MMP14的表达及分布情况,用逆转录聚合酶链式反应技术（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,Rt-PCR）及蛋白质印迹法（Western Blot）检测睾丸引带细胞中迁移相关蛋白MMP2和MMP14转录水平和蛋白表达情况,用划痕实验及transwell迁移实验检测实验组（增加了MMP抑制剂组）、溶剂对照组和空白对照组的细胞迁移情况。结果:1.免疫荧光预实验:MMP2及MMP14在睾丸引带细胞质里可见表达,且表达较高。2.划痕实验:12h后,MMP抑制剂组及DES组与正常组对比,划痕愈合速率均降低（P<0.01）,DMSO组与正常组对比,划痕愈合速率均无明显差异（P>0.05）。24h后,计算机已无法识别各组细胞划痕,但是在肉眼观察下,MMP抑制剂组、DES组均有划痕存在,DMSO及正常组已无肉眼可见划痕存在。结果提示,DES及MMP抑制剂可明显抑制划痕愈合速率。3.Transwell实验:DMSO组与正常组对比,下室迁移细胞数目无明显差异（P>0.05）。而MMP抑制剂组及DES组的下室均未见迁移细胞（P<0.01）。结果提示,DES及MMP抑制剂可明显抑制引带细胞由上室迁移到下室。4.RT-PCR检测MMP2及MMP14转录水平:DES组与正常组对比,MMP2、MMP14基因的转录水平降低（P<0.01）,DMSO组与正常组对比,MMP2、MMP14基因的转录水平均无显著性差异（P>0.05）。结果提示,DES能抑制引带细胞MMP2及MMP14转录水平。5.Western-blot检测MMP2及MMP14表达水平:DES组与正常组对比,MMP2及MMP14蛋白表达水平下降（P<0.01）,DMSO组与正常组对比,MMP2及MMP14蛋白表达水平均无显著性差异（P>0.05）。结果提示,DES能抑制引带细胞MMP2及MMP14的蛋白表达结论:1.MMP2及MMP14在小鼠睾丸引带细胞质上有表达,且表达较高。2.MMP2及MMP14参与睾丸引带细胞的迁移,可作为细胞迁移标志物。3.DES抑制小鼠睾丸引带细胞的迁移能力及引带细胞中MMP2、MMP14的表达。4.DES可能通过抑制小鼠睾丸引带细中MMP2和MMP14的表达进而抑制小鼠睾丸引带细胞迁移。
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