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广西是我国的主要甘蔗产区，总产量约占全国60%以上，但甘蔗生产施用氮肥量过高，生产成本高。因此合理施肥，提高氮肥利用率，降低甘蔗生产成本是当前广西甘蔗生产的重要任务。接种联合固氮菌有望让甘蔗受益于生物固氮而通过节省氮肥降低甘蔗种植成本。目前对与广西甘蔗联合的固氮菌的多样性还了解很少，对从广西种植甘蔗体内分离的固氮菌的内生特性还缺少研究，也没有确证特定联合固氮菌与广西甘蔗的联合固氮特性。本研究从广西主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)分离筛选出一批固氮菌，致力于建立从大量菌株中快速筛选鉴定固氮菌的方法，并筛选出具不同促植物生长特性的固氮菌，用gfp标记固氮菌，将靶细菌与ROC22甘蔗组培苗共培养，用激光扫描共聚焦显微镜检测固氮菌的内生特性，用15N同位素稀释技术检测靶细菌能否与ROC22甘蔗联合固氮。主要研究内容和结果如下：
1.从14个ROC22甘蔗种植区共采集根际土壤和甘蔗组织共30份，获得能在Ashby缺氮培养基上生长的细菌分离物196株，通过乙炔还原法测定固氮酶活性和PCR扩增nifH基因，确定了43株固氮菌。用3对通用简并引物扩增nifH的结果表明Z-引物比P-引物和U-引物更有效，从菌落与从细菌基因组DNA扩增nifH的效率相同。用基于Z-引物的菌落nifH PCR能快速地从大量菌株中筛选到固氮菌。16S rRNA基因序列分析显示其中41株的16S rDNA序列与肠细菌科的克雷伯氏菌属和肠细菌属的细菌相似，另两株固氮菌的16S rDNA序列分别与放线菌属和伯克霍尔德氏属的细菌相似。肠细菌可能是与ROC22联合固氮菌的主要类群。这些固氮菌还具有合成分泌嗜铁素和IAA、溶解无机磷和分解ACC等促植物生长特性。
2.DX120E是从ROC22体内分离的固氮菌中在Ashby培养基中固氮酶活性最高的，还具有分泌IAA和嗜铁素及溶磷的特性。16S rRNA基因序列分析显示DX120E与Klebsiella属的细菌最相似。将GFP标记的DX120菌株与ROC22组培苗在1/10 MS培养液中共培养，用激光扫描共聚焦显微镜观察到GFP标记的DX120E细胞定殖在根冠、根毛、侧根发生处及边缘细胞，与巴西甘蔗内生固氮菌Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5的定殖模式相似。DX120E侵入组培苗根的能力较强，定殖在甘蔗苗内的数量比PAL5多近一个数量级。接种DX120E和PAL5都能显著促进甘蔗苗的生长，接种DX120E提高甘蔗苗的干重和氮含量分别为35.4%和41.0%，接种PAL5提高甘蔗苗的干重和氮含量分别为25.8%和35.3%。15N同位素稀释技术检测到接种DX120E和PAL5对整株甘蔗苗的固氮效率分别为6.86%和6.78%。
3.CZ152S是从ROC22根际土壤中分离的一株固氮菌，是所分离43株固氮菌中唯一具有ACC脱氨酶活性的菌株，还具有溶磷和分泌嗜铁素的特性。对16S rRNA基因序列的分析显示CZ152S与洋葱伯克霍尔德氏菌群Burkholderiacepacia complex的细菌较相似，但CZ152S没有BCESM致病因子，对烟草叶片和洋葱鳞茎也没有致病作用。通过将CZ152S与ROC22组培苗共培养也能将CZ152S导入甘蔗苗内。接种CZ152S的甘蔗苗的干重和氮含量比不接种对照分别增加了46.8%和45.9%，15N同位素稀释检测显示CZ152S对甘蔗苗的氮素贡献是9.22%。在正常条件(25℃)和低温胁迫(4℃)条件下，接种CZ152S油菜的初生根长度都显著高于不接种对照。具有ACC脱氨酶的CZ152S可能通过降解ACC来降低油菜在发育和遭受胁迫时体内乙烯的水平，从而减轻乙烯对油菜初生根伸长的抑制。
4.革兰氏阳性菌16SH是从新台糖16号甘蔗茎内分离得到的一个固氮菌，根据16S rRNA基因序列分析归属于微杆菌Microbacterium属。通过三亲接合方法将来源于革兰氏阴性菌的广宿主的质粒pPROBE-pTetr-AT、-OT和-TT分别导入16SH，pPROBE质粒能在16SH体内成功复制，并表达gfp，建立了微杆菌的质粒遗传转化体系，为进一步研究微杆菌属细菌的分子机制奠定了基础。用激光扫描共聚焦显微镜观察发现标记gfp的16SH在根成熟区和伸长区表面形成生物膜，在根冠和根分生区不形成生物膜，能从侧根伸出时产生的裂缝进入根内部，定殖在根皮层的细胞间隙。在施中等氮肥水平下，接种16SH能显著提高甘蔗组培苗的生长，甘蔗苗的干重和氮含量比不接种的对照分别高28.1%和20.3%。15N同位素稀释检测证明16SH对甘蔗苗的氮素贡献有6.0%。在施低氮和高氮的条件下，16SH没有与甘蔗苗联合固氮，但也能提高甘蔗苗的干重和氮含量，这种促生效应可能与16SH分泌IAA的特性相关。接种甘蔗种茎的桶栽试验结果也表明16SH能促进甘蔗生长，增加茎径和株高；促进甘蔗生长的效应与品种相关，对巴西高固氮品种的促生效应比较显著。
总之，本研究建立了从大量菌株中快速筛选固氮菌的方法，建立了证实甘蔗内生固氮菌内生和联合固氮的研究体系，首次用显微观测证实了肠细菌和微杆菌在甘蔗中的内生性，首次证实了微杆菌与甘蔗联合固氮。本研究显示了甘蔗联合固氮菌Klebsiella sp.DX120E、Burkholderia sp.CZ152S、Microbacterium sp.16SH及G.diazotrophicus PAL5都可能通过其固氮和其它促植物生长特性在广西甘蔗生产中发挥积极作用。