近年研究数据表明，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发生率逐步上升。HCC的发生、转移及预后与肝癌细胞所处的微环境密切相关。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肝癌微环境内的重要组成部分，它位于肝窦周Disse腔隙内,约占肝脏细胞总数的8%-13%。当受到炎症、化学、病理等因素刺激后，静息态的HSC被激活，α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）呈阳性表达，细胞增殖活力变强，分泌大量细胞外基质（extracellular matrix,ECM）。体内外研究表明，HSC在肝纤维化和肝硬化中均起重要作用。在肝癌微环境中，活化的HSC获得肌成纤维细胞表型，通过分泌大量的ECM、趋化因子以及转化生长因子，在HCC的生物学恶性行为中发挥重要作用。同时，在肝硬化患者及大鼠肝硬化模型中，肝内交感神经过度兴奋，大量的去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）由交感神经末梢释放，进入外周，与HCC的发生发展密切相关。β2-肾上腺素受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)超家族的一员，能选择性地与NE和肾上腺素（epinephrine,E）结合，激活下游信号通路，介导多种生物学效应。本研究所前期研究发现，NE能促进HSC的增殖，抑制细胞凋亡，诱导ECM分泌。然而，HSC中β2-AR信号通路的活化是否会引起肿瘤微环境中细胞因子成分变化，促进HCC的发生发展，还未见相关研究报道。因此，本课题以过往研究为基础，探讨HSC中β2-AR信号通路激活对HCC的影响及其相关调节机制。临床基础研究对HCC患者肝癌组织中活化的HSC中β2-AR和β-arrestin2的分布表达情况进行研究；整体动物研究采用二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导野生型（wide type，WT）C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠建立肝癌模型，探讨β-arrestin2敲除对肝癌模型、肿瘤微环境中HSC的活化及T细胞亚群的影响，并研究在肝癌进展过程中α-SMA及β2-AR表达变化；体外研究选用人肝星状细胞株LX-2，采用共培养、质粒过表达等技术，探讨激活HSC中β2-AR通路对HCC细胞增殖、迁移的影响，及β-arrestin2对LX-2中β2-AR信号通路的调控作用。　　目的：　　收集临床HCC患者肝脏标本，检测肝脏组织HSC中β2-AR和β-arrestin2表达情况；整体动物实验，用WT C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠诱导肝癌模型，观察β-arrestin2对HCC的影响，以及β2-AR信号通路蛋白与肝癌进展的关系；体外使用细胞共培养、质粒转染等技术，检测激活HSC中β2-AR信号对HCC细胞功能的影响，以及过表达β-arrestin2对HSC中β2-AR信号通路的调节作用。　　方法：　　选取肝癌患者肝组织石蜡切片，通过免疫荧光双染法检测HSC中β-arrestin2、β2-AR的表达和分布；整体动物实验，采用β-arrestin2-/-小鼠腹腔注射DEN建立肝癌模型，通过观察肝脏病理、淋巴细胞亚群的比例、Western blot等方法，检测β-arrestin2缺失对肝癌发生发展的影响，以及对β2-AR下游信号通路ERK和Akt的调节作用；体外细胞实验，通过MTT、细胞划痕、Western blot等方法检测β2-AR激动剂对LX-2增殖和迁移能力影响；在细胞共培养条件下，通过MTT法和划痕实验，检测β2-AR激动剂刺激的LX-2细胞对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721增殖、迁移的影响；使用β-arrestin2过表达质粒转染LX-2细胞，通过Western blot和ELISA法检测β-arrestin2对β2-AR下游信号通路ERK和Akt信号通路的调节作用，以及对活化LX-2分泌CCL2的影响。　　结果：　　1.肝癌患者HSC中β-arrestin2、β2-AR的表达情况　　免疫荧光双染法检测肝内胆管结石和肝癌患者肝脏组织标本，结果显示，在肝癌患者肝脏中活化的HSC明显多于肝内胆管结石患者，且肝癌患者HSC中β-arrestin2的表达低于肝内胆管结石患者，而β2-AR表达高于肝内胆管结石患者。　　2.β-arrestin2基因敲除对小鼠肝癌的影响　　与WT小鼠相比，DEN诱导的β-arrestin2-/-肝癌小鼠恶性程度更高，脾脏指数和肝脏指数均上升。流式细胞术结果表明，与正常组相比，DEN诱导的肝癌模型小鼠脾脏中CD4+CD62L+T细胞比例上升，CD4+CD69+T细胞比例下降，Treg细胞比例上升。Western blot结果表明，相比于WT小鼠，β-arrestin2-/-小鼠肝组织中β2-AR、α-SMA和p-Akt的表达均增加。　　3.β-AR激动剂ISO和选择性β2-AR激动剂特步他林对LX-2细胞活化的影响　　MTT、划痕实验结果显示，与对照组相比，特步他林和ISO刺激后，LX-2增殖活力和迁移能力提高；Western blot结果显示，β2-AR激动剂使LX-2细胞中β2-AR和α-SMA的表达均升高。　　4.选择性β2-AR激动剂特步他林刺激的LX-2对人肝癌细胞功能的影响　　选用人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2，与选择性β2-AR激动剂特步他林刺激后的LX-2细胞上清共培养。MTT、划痕实验结果显示，相比于对照组，用特步他林刺激后的LX-2细胞上清培养的SMMC-7721、HepG2细胞增殖活力和迁移能力明显提高。　　5.特步他林对β-arrestin2过表达的LX-2细胞中相关蛋白表达及分泌CCL2的影响　　Western blot结果显示，相比于对照组，特步他林刺激的LX-2细胞能促进β2-AR和α-SMA表达。向LX-2细胞中转染pEGFP-C2-arrestin2质粒，抑制β2-AR和α-SMA的表达，p-Akt的表达也下降。ELISA结果显示，相比于对照组，特步他林刺激LX-2细胞能促进CCL2分泌；向LX-2细胞中转染pEGFP-C2-arrestin2质粒，抑制特步他林刺激的LX-2细胞分泌CCL2。　　6.ERK、Akt通路抑制剂对特步他林刺激的LX-2细胞分泌CCL2的影响　　ELISA结果显示，相比于对照组，特步他林刺激LX-2细胞能明显促进CCL2分泌。向LX-2细胞中预先加入LY294002（PI3K/Akt抑制剂），可抑制特步他林刺激的LX-2分泌CCL2，而预先加入U0126（MEK/ERK抑制剂）对特步他林刺激的LX-2分泌CCL2无明显影响。　　结论：　　1.在HCC患者的肝脏标本和DEN诱导的HCC模型小鼠中，活化的HSC增加，β2-AR表达也增加，提示HSC的活化和β2-AR高表达可能参与HCC进程。　　2.β-arrestin2-/-小鼠能加重DEN诱导的HCC模型的恶性程度，使脾脏CD4+CD62L+T细胞和Treg细胞比例上升，CD4+CD69+T细胞比例下降，促进β2-AR及其下游ERK和Akt信号通路的激活。提示β-arrestin2缺失通过上调β2-AR及其下游ERK和Akt信号通路，加重小鼠HCC模型的恶性程度。　　3.体外激动β2-AR可促进LX-2细胞活化，使p-ERK、p-Akt信号蛋白表达升高，提高LX-2细胞的增殖活力和迁移能力；用特步他林刺激的LX-2细胞上清与SMMC-7721和HepG2细胞共培养，可促进肝癌细胞的增殖活力和迁移能力，提示激活β2-AR信号通路蛋白能够活化HSC，恶化HCC微环境，促进肝癌细胞的生长。　　4.特步他林刺激下LX-2细胞中Akt信号通路激活，LX-2活化，促进CCL2分泌。向LX-2细胞中转染pEGFP-C2-arrestin2质粒，可抑制特步他林刺激的LX-2细胞中Akt信号通路激活，以及CCL2的分泌。预先在LX-2细胞中加入Akt抑制剂，可抑制特步他林刺激的LX-2细胞分泌CCL2，ERK抑制剂对其无明显影响。提示特步他林通过激活LX-2细胞中Akt信号通路，使其活化，分泌大量CCL2。