研究目的帕金森(Parkinson’s disease,PD)是以黑质多巴胺能神经元大量变性死亡为特征的严重神经退行性疾病,其神经元变性死亡的发生原因与病理机制,仍然是制约PD临床治疗的关键问题。研究表明p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)是肿瘤坏死因子受体家族的重要成员,以低亲和力与神经营养素(neurotrophins,NTs)结合,介导神经元存活、分化与髓鞘形成。近来发现NT前体分子如神经生长因子前体(pro-nerve growth factor, proNGF)能够以高亲和力结合p75NTR,并通过辅助受体sortilin的协助启动细胞凋亡,在脑发育和脑损伤神经元的凋亡中发挥重要作用。成年后p75NTR主要在某些病理状态下表达,如脊髓侧索硬化症(ALS)和阿尔茨海默病(AD)等,异常表达的p75NTR参与疾病过程中的神经元变性或细胞凋亡。但目前p75NTR与PD病理关系问题,仍是研究空白,本研究针对这一问题,探讨p75NTR与辅助受体sortilin在黑质的表达、细胞定位、KA损伤模型的动态变化、及其参与中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡的病理作用,为揭示p75NTR、sortilin凋亡信号参与PD病理发展机制和疾病治疗新靶点提供依据。研究方法①采用红藻氨酸(kainic acid,KA)立体定位注射黑质建立兴奋性毒性损伤动物模型。②通过半定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测p75NTR、sortilin、proNGFmRNA在黑质表达及其损伤后的变化。③免疫细胞化学、双标记、及激光共聚焦显微镜观察等方法,研究p75NTR、sortilin、proNGF在黑质多巴胺能神经元的定位。④Western Blot分析p75NTR、sortilin、proNGF蛋白在黑质的表达情况与水平变化。⑤F luoro-Jade C(FJC)染色方法显示和计数分析黑质神经元变性死亡。⑥细胞内凋亡信号的分析初步观察JNK、AIF细胞内信号通路的参与问题。主要结果1.发现p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达,KA损伤后导致其表达上调。①免疫细胞化学研究发现黑质p75NTR和sortilin的表达:在中脑黑质切片上,检测到p75NTR、sortilin阳性神经元,它们主要分布在黑质的致密部。双标记染色与激光共聚焦显微镜观察证明47%TH阳性神经元表达p75NTR,而sortilin表达于全部的TH阳性神经元。②RT-PCR实验证明黑质p75NTR、sortilin mRNA的表达:RT-PCR结果发现p75NTR、sortilin mRNA阳性条带,p75NTR条带大小为309bp,sortilin条带大小为438bp,与预期的结果相符。③KA损伤导致黑质p75NTR、sortilin表达上调: p75NTR mRNA相对光密度由正常黑质的0.489±0.079上升为1.06±0.11(p﹤0.01,t test);sortilin mRNA相对光密度由正常黑质的0.724±0.056上升为1.226±0.078(p﹤0.01,t test);KA损伤后p75NTR上调表达于所有的TH免疫阳性神经元,sortilin的细胞数由204±4上升到293±13,具有统计学差异(p﹤0.01)。2.p75NTR、sortilin表达上调参与KA损伤模型黑质多巴胺能神经元变性死亡①p 75NTR、sortilin共存于黑质多巴胺能神经元:在p75NTR/TH、sortilin/TH双标结果基础上,进一步观察到大量的p75NTR/sortilin双标记神经元分布在黑质致密部,这些双标记神经元占全部p75NTR神经元的71.8%。②proNGF免疫阳性存在黑质神经元及星形胶质细胞:免疫细胞化学结果显示proNGF定位于黑质致密部腹侧带的多巴胺神经元,并且发现proNGF定位于激活的星形胶质细胞。③p roNGF在KA损伤后呈现与p75NTR、sortilin共同上调现象: proNGF mRNA相对光密度由正常黑质0.18±0.037上升为0.703±0.059(p﹤0.01,t test); proNGF/TH双标细胞数由正常黑质40±5,增加到75±5,具有统计学差异(p﹤0.01)。④p 75NTR、sortilin、proNGF、FJC及TH阳性细胞在KA损伤后的d1、d3、d7天时的动态变化:细胞计数结果显示p75NTR、sortilin、proNGF逐渐增加,TH神经元逐渐减少,同时FJC标记的变性神经元逐步增加。p75NTR、sortilin、proNGF与TH的相关性检验结果显示,p75NTR、sortilin、proNGF与TH细胞的减少成负相关性,相关系数分别为-0.988、-0.998、-0.993。FJC的增加与TH的减少呈负相关,相关系数为-0.999。3. KA损伤后p75NTR上调启动细胞内凋亡信号途径①KA损伤后启动JNK信号途径: c-jun属于caspase依赖的信号途径,研究发现KA损伤后黑质c-jun表达明显增加,c-jun/TH双标细胞数由10±1增加到20±2;Western Blot显示c-jun蛋白相对表达量由0.749±0.048增加到1.087±0.109。KA损伤后c-jun的磷酸化水平增高,p-c-jun/TH的双标细胞由26±2增加到65±4。②KA损伤后诱导AIF表达增加: AIF属于caspase非依赖性的信号途径,发现AIF在KA损伤后细胞数明显增加,由正常195±3增加到243±14。而分布在黑质致密部AIF/TH阳性细胞由正常177±4减少到112±4。结论①首次发现p75NTR、sortilin在黑质多巴胺能神经元的表达与KA损伤后表达上调现象。②p 75NTR、sortilin表达上调参与了KA损伤模型黑质多巴胺能神经元变性死亡过程。③KA损伤模型中p75NTR、sortilin表达上调可能启动JNK和AIF等细胞内凋亡信号途径,导致神经元死亡。本研究初步阐明了p75NTR、sortilin作为凋亡信号参与黑质多巴胺能神经元变性死亡的病理作用,为进一步揭示PD发生和发展机制、探索PD治疗的新靶点提供了重要依据。