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万寿菊是提取天然类胡萝卜素的优质原材料,其类胡萝卜素代谢途径的研究具重要意义。本文以‘猩红色’万寿菊和‘非洲’万寿菊(分别简称为‘Sc’和‘MA’)的根、茎、叶、花4个器官为试验材料,采用Real-time PCR分析其类胡萝卜素代谢合成与降解途径中重要酶基因的表达特性;采用同源克隆的方法从万寿菊中获得类P450型细胞色素单加氧酶基因CYP97A和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因NCED2,构建载体,转目的基因到拟南芥中;并采用高效液相色谱方法检测转基因和非转基因拟南芥中类胡萝卜素含量变化;探讨万寿菊类胡萝卜素代谢途径中关键酶基因的功能特性。研究内容如下:1.万寿菊类胡萝卜素合成重要酶基因的表达分析采用Real-time PCR分析万寿菊类胡萝卜素合成代谢途径相关酶基因在2个品种4个不同器官基因表达量。结论如下:(1)ZDS、LCYb、LCYe和CYP97A基因在两个万寿菊品种根、茎、叶、花中均有不同程度的表达,4个基因在花中的表达水平均为‘猩红色’万寿菊高于‘非洲’万寿菊(P<0.01),表明上述基因可能与不同万寿菊花色差异的形成有密切关系。(2)CHYB在深色与浅色万寿菊品种花中的表达无显著性差异,推测CHYB可能不是万寿菊花色形成的关键酶基因。2.万寿菊类胡萝卜素降解重要酶基因的表达分析利用Real-time PCR方法检测万寿菊类胡萝卜素降解代谢途径的4个CCD基因在2个品种4个不同器官基因表达量。结论如下:CCD1、CCD4b、CCD7和NCED2基因在不同万寿菊品种根、茎、叶、花中均有不同程度的表达,4个基因在花中的表达水平均为‘非洲’万寿菊高于‘猩红色’万寿菊(P<0.01),表明上述基因可能与不同万寿菊花色差异的形成有密切关系。3.万寿菊P450型细胞色素单加氧酶97A基因的克隆与功能分析克隆获得万寿菊CYP97A(GenBank登录号MK061379)的cDNA全长序列为2 184 bp,编码区长度1 821 bp,推测其编码606个氨基酸。蛋白分析预测表明TeCYP97A为亲水性蛋白,主要定位在叶绿体(质体)中。蛋白多序列比对表明万寿菊TeCYP97A蛋白序列保守,进化树分析显示万寿菊TeCYP97A属于P450型细胞色素单加氧酶的97A家族(CYP97A)。高效液相色谱分析表明CYP97A基因提高了叶黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄素在转基因拟南芥叶片中的含量。推测CYP97A可能是万寿菊类胡萝卜素合成代谢途径中影响其花色变化的关键酶基因。4.万寿菊9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因的克隆与功能分析克隆获得万寿菊NCED2(GenBank登录号MK061380)的cDNA全长序列为2 258 bp,编码区长度为1 791 bp,推测其编码596个氨基酸,蛋白分析预测表明TeNCED2为亲水性蛋白,主要定位于叶绿体(质体)中;蛋白多序列比对分析表明万寿菊TeNCED2具有NCED家族共同的保守结构域特点;系统进化树研究显示万寿菊TeNCED2属于NECD家族,蛋白序列保守。高效液相色谱分析表明NCED2基因降低了叶黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄素在转基因拟南芥叶片中的含量。推测NCED2是万寿菊类胡萝卜素降解代谢途径中影响其花色变化的关键酶基因。