下肢缺血及心肌梗死等心血管疾病具有相同的病理生理基础,是严重威胁人类健康的一类疾病,骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）治疗在下肢缺血及心肌梗死后血管再生及功能恢复方面的表现令人惊喜,可能产生革命性的治疗方法。目前认为间充质干细胞疗法,主要是通过其旁分泌途径发挥作用的,而BMSCs在生物体内所处微环境的不同,其表现出的生物学效应也截然不同。因此,BMSCs在体内的旁分泌的研究,探究其新生蛋白谱的变化情况,具有十分重要的意义。点击化学技术（click chemistry）基于azide及alkyne基团的共价结合反应,迅速高效,它分子量极小,反应条件温和。通过基因工程制作特定细胞的突变甲硫氨酰-tRNA合成酶（MetRS）,则能够在翻译过程中掺入非经典氨基酸叠氮亮氨酸（ANL）以取代甲硫氨酸（Met）。因为甲硫氨酸是大多数真核生物起始密码子所翻译的蛋白质,这使得ANL可以广泛而全面的存在于所有新合成蛋白中。下一步,通过基于click反应的alkyne基团修饰富集,可进行质谱分析检测,从而达到分析特定细胞群的新生蛋白合成情况的目的。在课题组前期研究的基础上,我们成功构建了 MetRS-BMSCs细胞系。验证了 clcik技术对BMSCs新生蛋白标记的能力,发现其具有高度敏感性和特异性。在本研究中,我们探索了 click技术在细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）上的应用,通过一系列优化的实验设计,证实了 click技术在活性EVs标记示踪的应用可行性。我们还构建小鼠下肢缺血模型,通过基于click技术的蛋白质分选及质谱分析,观察了 BMSCs在下肢缺血组织内蛋白表达谱的改变,发现小鼠下肢缺血后的前7天是决定BMSCs疗效的关键阶段,因为在这个时段内,以Atp5a1,Mdh2,Sdhb为代表的凋亡蛋白表达占据主导地位。随后的7-14天内,能量代谢相关蛋白（如Gm6096,Rp134,Rp14,Eef2等）又逐渐增多,表明BMSCs主要通过改变自身及缺血组织的能量代谢情况,帮助其功能恢复和血运重建。除此之外,BMSCs在缺血损伤的修复过程中,还分泌大量的组织重塑蛋白Mybpc2、My12、Myh4、Mylpf,这些结构蛋白的表达升高,可能是其发挥细胞保护作用的关键所在。随后,将带有ANL标记的EVs经尾静脉注射入心肌梗死小鼠动物模型体内,观察了 BMSC-EVs在心肌梗死状态下在体内的分布及摄取情况。我们发现外源性BMSC-EVs会向心肌梗死小鼠心脏趋化,进一步的分析发现BMSC-EVs相关蛋白出现在假手术组动物心脏细胞的胞膜上,而在心肌梗死组则出现在胞质部分,可能是由膜通透性的增加所致的。EVs介导的DSG-1向心肌细胞转移可能参与了 MSC-EVs的心脏修复作用。整个课题,从click技术的建立到检验,从蛋白水平的观察到细胞外囊泡水平的探究,立体的探究了click技术在研究干细胞治疗缺血性心血管疾病过程中的应用价值,为今后干细胞疗法的机制研究提供了有力的武器。