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γ-聚谷氨酸和纳豆激酶是芽孢杆菌合成的两种重要的生物物质。γ-聚谷氨酸是一种水溶性的,可食用的,对人体和环境无毒害的可生物降解的高分子,可以广泛应用于食品、化妆品、医药及水处理等领域。纳豆激酶是一种新型的用于治疗和预防心脑血管栓塞的有效溶栓剂。本文从合成纳豆激酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NattoNLSSe出发,探索了纳豆激酶和γ-聚谷氨酸的联产工艺条件。
实验结果表明,该菌株能在不添加谷氨酸的培养基中发酵合成γ-聚谷氨酸,是谷氨酸非依赖型菌株,根据文献中报道的γ-聚谷氨酸合成相关基因设计引物,在不同退火温度条件下对相关基因进行PCR扩增,均没有得到预期的目标条带,推测可能是谷氨酸非依赖型菌与谷氨酸依赖型菌的γ-聚谷氨酸生产相关的基因同源性较低,两者生产γ-聚谷氨酸的机理并不相同。
该菌株合成的γ-聚谷氨酸的分子量在200-300万Dalton之间。对γ-聚谷氨酸合成最有利的碳、氮源分别是柠檬酸和NH4Cl,在37℃培养96 h后其产量达到最大。在培养的初始阶段,随着微生物的快速生长及γ-聚谷氨酸的合成,柠檬酸的浓度迅速下降,从最初的20 g/L下降到2g/L,而NH4Cl的利用速率较慢;培养后期,微生物生长和γ-聚谷氨酸合成的速率减慢,柠檬酸浓度下降速率也随之减缓。
在发酵培养72 h后发酵液中纳豆激酶酶活达到最大。对纳豆激酶合成最有利的碳源、氮源分别是蔗糖和大豆蛋白胨。对关键培养基组分进行正交实验,结果表明,柠檬酸对γ-聚谷氨酸产量影响较大,而对纳豆激酶酶活基本没有太大影响;大豆蛋白胨对纳豆激酶酶活有显著性影响,但是对γ-聚谷氨酸的影响很小。利用本实验菌株进行了γ-聚谷氨酸和纳豆激酶的联产研究,对纳豆激酶和γ-聚谷氨酸联产最有利的培养基组成为大豆蛋白胨10g/L,NH4Cl9g/L,柠檬酸15 g/L,在37℃培养72 h,纳豆激酶酶活达到121 units/mL,γ-聚谷氨酸产量达到1.1 g/L。