微囊化转重组hIL-10基因细胞株的构建

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Ⅰ型糖尿病是目前严重危害人类健康的常见病、多发病,全世界约有2%-5%的人患有此种疾病,且呈逐年增长趋势,多见于儿童和青少年。从降糖药物到胰岛素,从胰腺移植到胰岛移植,Ⅰ型糖尿病的治疗经历了一个漫长的过程。而目前微囊化胰岛移植是糖尿病治疗的研究热点。由于微囊化技术的应用,在很大程度上解决了移植过程中的免疫排斥问题。然而小分子的炎症因子仍然能够透过微囊对移植物造成损害,最终导致胰岛死亡。 IL-10是一种35~40kD的酸性蛋白,由两个同源的亚基组成.它具有抗炎和抑制多种细胞因子合成的作用,所以称之为细胞因子合成抑制因子(CytokineSyntllesis Inhibiting Factor,CSIF)。目前很多实验证明IL-10具有抗炎症活性和免疫抑制活性,为一种潜在的免疫增殖反应和炎症反应的负性调节因子,是针对器官移植的良性细胞因子。 基于上述原因,本研究通过构建稳定表达hIL-10的基因工程细胞株并将其微囊化,把hIL-10与微囊技术结合起来应用于胰岛移植治疗糖尿病的研究。 方法: (1)制备微包囊,并对其性能进行检测。(2)从人外周血淋巴细胞中克隆hIL-10基因,在其5端添加鼠白蛋白信号肽核酸序列,将这段cDNA插入pcDNA3,构建hIL-10基因真核表达载体。(3)脂质体法转染c2c12细胞,经过G418药物筛选,挑单克隆得到了稳定表达hIL-10的c2c12/hIL-10细胞株,(4)c2c12/hIL-10细胞株微囊化制得微囊化基因工程细胞,观察微囊化c2c12/hIL-10细胞在体外的生长,并检测培养上清中hIL-10的分泌情况。 结果: (1)微囊在机械强度,生物相容性,以及通透性方面均达到了移植的要求;(2)将真核表达载体进行测序,序列分析结果表明鼠白蛋白信号肽核苷酸序列的同源性达到96%,hIL-10核苷酸序列同源性为100%,并且读码框正确都为相同的氨基酸编码;(3)基因转染数周后,在RNA水平上检测到hIL-10基因;免疫组织化学检测到hIL-10蛋白表达,western blot检测到细胞培养上清液中有hIL-10蛋白表达分泌;(4)把c2c12/hIL-10细胞包微囊,western blot检测hIL-10能分泌到微囊外,MTT检测微囊化基因工程细胞体外增殖情况,结果表明微囊化并没有抑制细胞的增殖,只是在细胞增殖的起始阶段出现滞后。 结论:正确的构建了hIL-10基因真核表达载体,并且得到了稳定表达hIL-10的c2c12/hIL-10细胞株, c2c12/hIL-10细胞微囊化后细胞在微囊中能够继续增殖,并且hIL-10能够分泌到微囊外发挥作用。
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