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梗阻性黄疸(obstructive iaundice,OJ)造成肠黏膜屏障损伤,可引发各种感染并发症,严重者导致败血症及多脏器功能衰竭。近年来对OJ肠黏膜屏障损伤的研究引起了国内外学者的广泛关注。肠黏膜屏障最重要的结构是肠上皮细胞间的紧密连接(tight junction,TJ),它对维护肠黏膜屏障功能和肠黏膜的通透性起重要作用。TJ是构成上皮屏障功能的重要结构,也是肠上皮细胞间的主要连接方式,对肠道黏膜通透性起决定性作用,能有效阻止肠腔内有害物质,如毒素或细菌穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环,而仅对离子、氨基酸等营养物质选择性通过。现已证明,有多种蛋白质参与TJ形成,主要有闭锁蛋白(Occludin)、claudin蛋白、Zos(zonula occludins)蛋白以及连接黏附分子(iunction adhesion molecular,JAM)等。TJ的破坏及其导致的肠黏膜屏障受损使得肠上皮对有害物质的通透率增加导致炎症及黏膜损伤。
梗阻性黄疸伴随肠黏膜氧化应激反应(oxidative stress),后者可能是导致肠黏膜屏障损伤和通透性增高的一个关键因素。血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)是一种多功能微粒体氧化酶的诱导型,其活性可在多种应激状态下被诱导。已经证实该酶系氧化应激的主要敏感指标之一,该诱导作用被认为是机体对各种氧化应激刺激的一种适应性保护反应。HO-1降解血红素产生等摩尔的胆绿素(biliverdin),一氧化碳(carbonmonoxide,CO)和游离铁(iron),其中胆绿素迅速被胆绿素还原酶还原成胆红素(bilirubin)。HO-1/CO系统可能参与机体应激状态下的细胞保护机制,在多种疾病的发生发展过程中表达增加,对机体起保护作用,有利于减少细胞死亡、蛋白质氧化及脂质过氧化等。
白藜芦醇(resveratrol,Res)即反3,4',5-三羟基二苯乙烯,属于黄酮类化合物,是一种重要的植物抗毒素和抗氧化剂,可以抵御活性氧介质对DNA的损伤,并且防止细胞膜发生脂质过氧化反应,具有抗炎、抗过敏和抗诱变作用。Res的抗氧化、抗自由基效应对预防和治疗因氧化损伤引起的各种紊乱和失调具有非常重要意义。近年来,越来越多的研究表明Res对许多器官、组织和细胞都具有保护作用,Res作为一种抗氧化剂,具有清除氧自由基抑制NF-κB激活作用。已经证实Res是一种天然的HO-1强诱导剂。
因此,本研究重点探讨了Res对梗阻性黄疸肠黏膜上皮屏障及氧化应激保护作用及其机制。实验内容主要包括以下4部分:
第一部分:恶性梗阻性黄疸患者小肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白表达变化及意义
目的:探讨恶性梗阻性黄疸(malignant obstructive jaundice,MOJ)患者小肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白表达变化及意义。
方法:收集行内镜逆行胰胆管造影(ERCP)检查或治疗的恶性胆道梗阻伴黄疸患者15例;恶性胆道梗阻无黄疸患者10例;并以胃镜检查健康体检者10例作为对照组。取十二指肠乳头以下2-5cm范围内肠黏膜组织观察其形态学改变,应用免疫组织化学和western blot方法检测MOJ患者肠黏膜紧密连接蛋白Occludin、ZO-1分布及表达的变化。
结论:MOJ伴黄疸患者小肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达减少,这可能是MOJ患者肠黏膜屏障损伤、通透性增加的重要原因。
第二部分:恶性梗阻性黄疸患者肠黏膜氧化应激损伤中血红素加氧酶-1表达增加
目的:探讨血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)在恶性梗阻性黄疸(malignant obstructive jaundice,MOJ)患者小肠黏膜表达及其在氧化应激损伤中的作用。
方法:采用前瞻性研究,收集行ERCP检查或治疗的恶性胆道梗阻伴黄疸患者15例;恶性胆道梗阻无黄疸患者10例;并以胃镜检查健康体检者10例作为对照组。取十二指肠乳头以下2-5cm范围内肠黏膜组织,应用比色法检测组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,原位缺口末端标记法(TdT-mediateddUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法检测细胞凋亡。应用免疫组织化学和western blot方法检测MOJ患者小肠黏膜HO-1分布及表达的变化。
结论:MOJ患者小肠上皮细胞存在氧化应激损伤,同时随着胆道梗阻的不断进展HO-1蛋白表达明显升高,这可能是减轻肠黏膜损伤的一种保护性反应。
第三部分:白藜芦醇对实验性梗阻性黄疸大鼠肠黏膜上皮屏障及氧化应激保护作用
目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对梗阻性黄疸(obstructivejaundice,OJ)大鼠肠黏膜上皮屏障及氧化应激的保护作用。
方法:建立OJ大鼠动物模型,将60只Wistar大鼠随机分为5组,假手术组(sham operation,so),胆总管结扎组(bile duct ligated,BDL),胆总管结扎+溶剂组(BDL+vehicle),胆总管结扎+Res干预组,分别设10 mg/kg和20mg/kg两个浓度组,于1 wk、2 wk两个时间点取材。取末端回肠黏膜组织观察其形态学及超微结构改变,采用鲎试剂终点显色法检测血浆内毒素(endotoxin,ET)含量,应用比色法检测组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡。应用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem massspectrometry,LC-MS/MS)测定大鼠尿样乳果糖(lactulose)/甘露醇(mannitol)比值(L/MLL值)。应用免疫组织化学和western blot方法检测末端回肠黏膜HO-1及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin分布和表达,real time PCR方法检测HO-1 mRNA水平。
结论:梗阻性黄疸大鼠存在高内毒素血症、小肠黏膜的氧化应激损伤,肠黏膜细胞凋亡增加,通透性增加,小肠黏膜上皮ZO-1,Occludin分布紊乱,表达下降,小肠黏膜上皮屏障的完整性破坏,HO-1蛋白表达及基因水平升高,Res可能通过诱导HO-1的蛋白和基因表达来保护肠黏膜上皮屏障及氧化应激损伤。
第四部分:白藜芦醇对肠单层上皮氧化应激损伤的保护作用
目的:白藜芦醇对H2O2介导的肠单层上皮氧化应激损伤的保护作用。
方法:建立Caco-2单层细胞模型,用H2O2模拟OJ肠黏膜氧化应激状态。实验分为DMSO组,H2O2(500μM)组,H2O2+不同浓度Res组(1,10,20μM),H2O2+Res(20μM)+Znpp(HO-1特异性抑制剂,20μM)组,共同孵育1 h、3 h、6 h后,收集细胞培养液检测乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD);测量肠单层上皮的跨上皮细胞电阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)和荧光素钠透过率:Western blot和免疫荧光化学方法检测ZO-1和Occludin在肠单层上皮的表达及定位;Western blot和real-time PCR方法检测HO-1蛋白及mRNA表达水平。
结论:H2O2能导致肠单层上皮氧化应激损伤,引起紧密连接蛋白破坏和肠上皮屏障功能受损。Res可能通过诱导HO-1蛋白和基因表达改善H2O2导致的肠黏膜屏障氧化应激损伤。