反刍动物CH4排放会造成能量损失和温室效应，硝酸盐可有效降低CH4排放，同时为反刍动物提供氮源。目前认为，其降低甲烷排放的机制是其代谢产物亚硝酸盐对产甲烷菌的抑制作用，以及其消耗氢因而减少了产甲烷菌的底物。本研究推测瘤胃中可能同时存在甲烷厌氧氧化偶联反硝化(DAMO)细菌、DAMO古菌和氨基氧化菌，即硝酸盐可促进甲烷厌氧氧化从而降低了瘤胃CH4排放。本试验首先检测了添加硝酸盐和铵盐对短期发酵甲烷排放和微生物结构的影响，并在此基础上研究以甲烷为唯一碳源对瘤胃中可能存在的硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化菌进行富集培养，揭示瘤胃中硝酸盐及亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化菌多样性，为安全利用硝酸盐降低甲烷排放提供研究基础。试验包括三部分:　　试验一添加硝酸盐和铵盐对体外瘤胃液培养体系甲烷排放及微生物结构的影响　　本试验旨在研究瘤胃液体外培养体系中是否存在已发现的DAMO相关细菌、古菌和氨基氧化菌，并分析添加硝酸盐是否会促进DAMO相关微生物的增殖从而降低CH4排放。试验分别添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4C1以及两者混合添加对瘤胃短期发酵气体体积、CH4总产量、发酵参数、硝酸盐/亚硝酸盐浓度、干物质降解率、总菌数量和产甲烷菌、NC10门细菌、ANME-2d古菌和氨基氧化菌相对总菌比例的影响。结果显示:1）添加硝酸盐、铵盐组和混合添加对培养体系中pH、挥发性脂肪酸、干物质降解率、中性洗涤纤维降解率、酸性洗涤纤维降解率、亚硝酸盐浓度和总菌数量均无明显影响(P＞0.05)，均显著提高了氨态氮浓度(P＜0.05)，并显著降低发酵气体总产量(P＜0.05);2)硝酸盐组显著提高了发酵液中硝酸盐的浓度(P＜0.05)，而同时添加硝酸盐和铵盐对发酵液中的硝酸盐和亚硝酸盐浓度无影响(P＞0.05);3)添加硝酸盐和混合添加可显著降低CH4体积以及产甲烷菌相对总菌的比例(P＜0.05);4)特异引物PCR检测显示，瘤胃中存在NC10，且添加硝酸盐和混合添加显著提高了NC10门相对总菌的比例(P＜0.05);5)采用ANME-2d和氨基氧化菌特异引物PCR未检测到DAMO古菌和氨基氧化菌。　　试验二瘤胃液中硝酸盐偶联甲烷厌氧氧化菌多样性研究　　本试验利用16s rDNA高通量测序技术分析了分别添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4Cl以及两者混合添加对富集培养11个月过程中体系微生物菌群结构的影响，分析了可能存在的硝酸盐依赖型甲烷氧化菌菌属组成，并利用同位素(13CH4)标记方法检测培养体系是否存在甲烷厌氧氧化过程。结果显示，富集培养体系存在甲烷厌氧氧化过程。富集培养过程使瘤胃液中的优势菌门拟杆菌门由56.73％最终降低到0.25-0.85％，铵盐组厚壁菌门丰度由40.57％最终降低到2.44％，硝酸盐、铵盐和混合组变形菌门丰度分别由1.18％提高到89.41％、51.13％和69.41％，其中OTU1(属于Paracoccus)和OTU2(属于Phenylobacterium)等成为富集培养体系中的优势菌群，富集培养后其丰度范围分别为0.08％-53.22％和0.1％-19.01％，并使瘤胃微生物区系的菌种数量分别降低到288、322和179个;随着富集培养，体系中OTU5（属于Methanobacterium）丰度由未检测到分别升高到5.81％(A04)、4.95％(B06)和9.1％(C09)。本次试验采用通用引物进行高通量测序未检测到瘤胃中存在NC10门和氨基氧化菌。富集培养体系不存在ANME-2d。　　试验三16srDNA序列分析法检测奶山羊瘤胃液中NC10的多样性　　试验一通过特异引物PCR检测到瘤胃液中存在NC10门，但试验二利用推荐的通用引物对原始瘤胃液及富集培养液中菌群进行高通量测序却未检测到NC10门，说明目前推荐的通用引物存在局限性。鉴于此，利用NC10特异引物对瘤胃液菌群进行了16srDNA分析，以检测瘤胃液中NC10门的组成。结果表明，瘤胃液中NC10门菌种存在多样性，一共检测到了8个OTU与M.oxyfera属于同一分枝，但16s rDNA序列相似性不高于87％。　　综上，添加硝酸盐可促进瘤胃液体外发酵体系中NC10门细菌的增殖，并因此降低了甲烷排放;同时添加硝酸盐和铵盐可加速硝酸盐的还原和亚硝酸盐的代谢。富集培养体系中存在甲烷厌氧氧化过程，富集培养后体系中的优势菌门为变形菌门，这些优势菌中有能够氧化甲烷和还原硝酸盐的菌属，推测其为瘤胃液中的硝酸盐偶联型厌氧甲烷氧化菌;特异引物PCR和16s rDNA高通量测序均未检测到DAMO体系中的古菌ANME-2d。瘤胃液中存在NC10多样性。根据富集培养中微生物区系组成可以推测，瘤胃中存在不同于淡水淤泥中DAMO体系的其他甲烷厌氧氧化偶联反硝化体系。