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研究背景肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,尽管通过手术切除和肝脏移植可以提高患者生存率,但仍然由于侵袭和转移而高复发。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)在肿瘤形成和进展中起到重要作用,该细胞具有自我更新的能力。边缘群细胞(side population,SP),从多数肿瘤细胞系中分离出来均具有干细胞特性及表型。研究证实,SP细胞是理想的肿瘤干细胞研究的模型。Micro RNAs是调控肿瘤发生发展的非编码小RNA,在多数肿瘤中充当抑癌基因。最新研究表明,Mi R-200家族不但参与调控细胞的分化、增殖、凋亡等一系列的生命活动过程,而且与肿瘤的发生、发展相关。Mi R-200a可通过与ZEB基因非编码区3’端结合调控其表达。而ZEB可与E-钙粘蛋白基因启动子结合,抑制其转录。本研究拟通过肝癌干细胞研究mi R-200a,揭示肝癌的发生发展,为肝癌的防治提供新思路和新靶点。目的目前micro RNAs的研究主要在常规肿瘤细胞中研究,在对于肿瘤的侵袭、转移、复发过程中作用更重要的肝癌干性样细胞中研究mi R-200a/ZEB通路,将对干预肝癌侵袭、转移、复发更有意义。方法1、边缘群细胞分选:选择肝癌细胞系高、低侵袭性的MHCC-97H和Huh7细胞经hoechst33342染色和(或)verapamil阻断后,用FACS-III流式细胞分选仪紫外激光激发识别,分选出肝癌SP细胞和非SP细胞。检测SP细胞和非SP细胞干性标志物ALBU、KRT14表达水平,确认分选出的亚群细胞即为SP细胞。2、干预mi R-200a的表达对SP和非SP细胞生物学特性及EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)的影响:检测mi R-200a及下游分子ZEB的表达情况,验证活化效果。通过免疫组织化学、PCR技术、western-blot蛋白检测技术检测EMT标志分子E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表达变化。3、干预ZEB表达拮抗mi R-200a干预的影响:SP和非SP亚群细胞中同时干预mi R-200a和ZEB的表达水平,检测干预ZEB是否可拮抗mi R-200a干预后对SP细胞恶性表型的影响。4、Mi R-200a/ZEB通路干预前后对SP细胞体内成瘤的影响:(1)成瘤大小;(2)成瘤时间;(3)转移灶的情况;(4)E-cadherin、vimentin、N-cadherin表达。结果1、mi R-200a在肝癌细胞系和肝癌组织中为低表达,并根据肝癌患者临床病理的统计分析,mi R-200a与肝癌的侵袭转移相关;2、通过流式细胞仪成功分选出SP细胞;3、mi R-200a在SP细胞中表达低于其他亚群;4、调控SP细胞中mi R-200a的表达后,SP细胞的侵袭转移能力发生变化:体内及体外实验证实;5、调控mi R-200a后,ZEB2发生明显变化,恢复ZEB2表达后,可以逆转mi R-200a引起的侵袭转移特性(体外实验),mi R-200a可能通过ZEB2调控SP细胞的侵袭转移能力。结论本研究证实,在肝癌细胞系以及肝癌边缘群细胞中,mi R-200a为低表达状态,并通过ZEB2促进了肝癌干性样细胞恶性表型的转化,诱导EMT的发生,促进了肝癌的转移。