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前言 缺血性脑血管病中的脑血栓形成是各种原因导致脑动脉闭塞，使动脉供血区脑组织缺血、缺氧而发生软化和坏死，为脑血管病的常见类型，也是神经系统的多发病，其以高发病率、高致残率、高病死率和高复发率严重危害着人们的身体健康。缺血性脑血管病目前主张积极溶栓治疗，但溶栓治疗中的缺血再灌注损伤问题一直是一个难以解决的问题，关于它的具体病理生理机制，目前尚未完全阐述清楚，普遍认为对于缺血性损伤，由于ATP的耗竭，引起线粒体功能障碍，细胞内钠离子、钙离子和氧自由基聚集。随后是包括蛋白酶、NO合酶，磷酸化酶和核酸内切酶等多种酶体系的活化，引起细胞骨架的破坏，细胞膜的损伤，DNA的降解，最终导致细胞的死亡。在缺血再灌注损伤中，同时活化补体，细胞因子，趋化白细胞到缺血区引起进一步的的损伤。总而言之，缺血性脑缺血再灌流后神经损伤的机制是一个复杂的多因素过程，主要与氧化应激反应、炎症反应、钙超载、脑水肿和细胞凋亡等有关。ADM是近年来发现的一种血管活性多肽，属于降钙素基因相关肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)家族。ADM是一种有52个氨基酸组成的舒张血管的活性多肽，近年发现ADM与多种组织的缺血再灌注损伤有关系，而且最近有人证实在中枢神经系统有ADM的表达，并与脑缺血再灌注损伤有一定关系，故选用大鼠制作局灶性脑缺血再灌注模型，应用免疫组化的方法观察ADM在正常大鼠脑组织中的分布及缺血再灌注后ADM分布有无改变，进一步评估ADM与脑缺血再灌注损伤的关系。 实验材料与方法 1．材料与仪器 1．1 动物 选用雄性S-D大鼠，体重(250±20g)(中国医科大学实验动物中心提供) 1．2 主要试剂： l)一抗:兔抗鼠ADM一I步一抗工作液(浓缩型0.Znil) 2)二抗:生物素化二抗 3)SABC免疫组化试剂盒 1.3主要仪器: (1)石蜡切片机 (为37%孵箱 (3)显微图象分析系统型号:Me扭M。甲扮C一5050/BX一41，生产厂:UIC/OLYMPUS，US/TP (4)4℃冰箱 (5)olympus CK 40相差光学显微镜及照相装置 4.其他材料: (1)3%的HZO:一甲醇液 (2)PBS缓冲液 (3)正常羊血清 ‘(4)0.05%DAB显色液 (5)苏木素、二甲苯及100%一70%不同浓度的酒精 (6)10%水合氯醛 (7)4%多聚甲醛 (8)灌注器 (9)尼龙鱼线及缝合线 (10)动脉夹及手术器械 2.方法实验方法 2 .1动物分组S一D大鼠随机分成正常对照组、假手术组和缺血再灌注组。 2.2大鼠大脑中动脉栓塞模型制备采用Zea助nga改良法 2.3常规HE染色，光学显微镜观察。 2.4脑组织中ADM蛋白表达检测采用免疫组化法。实验结果1.脑组织切片HE染色光镜观察对照组、假手术组和缺血对侧脑组织皮层细胞层次分明，神经细胞形态 ·2·结构正常。缺血再灌注组缺血侧额顶叶皮层、皮层下白质及基底节区神经元减少、排列紊乱，细胞周围间隙增宽，有大量坏死神经元，胞体肿胀、胞浆淡染、胞核溶解、结构不清，梗死边界区可见大量固缩神经元。 2.免疫组化结果分析 免疫组化结果显示人DM免疫阳性神经纤维或神经细胞在大鼠脑内广泛分布。ADM免疫阳性细胞存在于大鼠几乎每一个脑区，包括大脑皮层、室旁组织、脉络丛、下丘脑、小脑和延髓，其中脉络丛、室旁组织、下丘脑为高表达区。假手术组与正常对照组相比未见明显差异。大鼠脑缺血再灌注后ADM免疫阳性细胞增多，以缺血侧半暗带区域增多最为明显。脑缺血再灌注2小时后，ADM免疫阳性细胞增多，以脑缺血再灌注后6小时增多最为明显，至1周时仍增多。大脑皮层许多椎体细胞ADM免疫活性明显增强且细胞形态正常，而无免疫活性的细胞损伤明显。讨论 ADM是一种有52个氨基酸组成的舒张血管的活性多肤，其主要来源是血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，以前者为主。儿tamuraK等人应用放射免疫分析和反相高压液相色谱法发现，在红常人的血浆、肾上腺髓质、肺和肾中均含有肾上腺髓质素，但在脑中未发现有肾上腺髓质素存在。最近Satoh等人应用一种灵敏度和特异性较高的放射免疫分析方法，在所检查的人脑每一脑区均发现有免疫活性的ADM存在，其中在丘脑中含量最高，其次为下丘脑和桥脑，而在大脑皮层、小脑和延髓中的含量略低。在大鼠脑内，ADM mRNA的广泛表达与ADM免疫阳性细胞的广泛分布相一致。因此脑内不仅可以合成ADM，也可分泌和释放ADM，在中枢发挥调节心血管功能的作用。魏英杰等人应用免疫组化的方法，发现ADM免疫阳性神经纤维或神经细胞在大鼠脑内广泛分布。免疫活性的ADM不仅存在于肾上腺髓质，也存在于大鼠几乎每一个脑区，包括大脑皮层、室旁组织、下丘脑、小脑和延髓。本实验使用免疫组化方法显示正常脑组织中有ADM免疫阳性细胞分布，且分布范围与魏英杰等人所显示结果相似。曾有数据显示外科处理本身足以刺激ADM分泌，可能来自内皮细胞。但本实验显示外科处理对脑组织内ADM的表达?