原发性肝癌（Primary liver cancer）是一种恶性度非常高的肿瘤,2020年全球肝癌新发病例91万,位居肿瘤发病第6位,而肝癌死亡例数83万,高居第三位。肝细胞癌（Hepatic cell carcinoma,HCC）是原发性肝癌最常见的病理类型,约占80%以上。目前全球针对肝细胞癌有效的治疗方法有限,治疗疗效和预后均不理想。近年来研究者对肿瘤细胞在能量和代谢方面的变化进行了深入的研究,在缺氧和低营养的肿瘤微环境中,肿瘤细胞为了维持在乏氧微环境下的生存及增殖优势,能够以更高的效率吸收葡萄糖并产生能量,在有氧条件下将糖酵解作为其主要产能方式,这一有氧糖酵解代谢模式即著名的Warburg效应。丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）是Warburg效应上催化及限速酶,在人体内存在L、R、M1、M2四种亚型,M2型丙酮酸激酶（PKM2）是Warburg效应和肿瘤发生之间的连接因素,它在肿瘤组织中引起Warburg效应的同时伴随糖耗量增加,乳酸产生增多,肿瘤生长速度增快。PKM2在包括肝细胞癌的多种实体肿瘤中表达量升高,但与肝癌的临床病理、生化特征及预后的关系研究不多,本研究先从全球的数据库下载不同国家肝细胞癌患者相关临床数据,同时检索HCC患者的RNA-seq表达数据,分析患者PKM2的表达量及其对应临床数据。采用单因素logistic回归分析的方法,对PKM2的表达水平与肝细胞癌临床特征的相关性进行研究。通过多因素COX回归分析,来评估PKM2的表达水平对肝细胞癌患者生存状态的独立影响。接着我们在临床对144例中国肝癌患者的病理组织及癌旁组织PKM2表达与临床特征及生化指标进行分析对比,进一步了解PKM2的表达与HCC临床特征的关联以及不同种族国家HCC患者在PKM2表达上的差异。环氧合酶（Cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素合成过程中的关键限速酶,当机体遇到细胞因子、缺氧、幽门螺杆菌感染和细胞致癌物质等因素的攻击,可能触发COX-2的快速瞬时表达,以调节炎症和癌变,COX-2可以促进肿瘤生长、抑制肿瘤凋亡、促进肿瘤周围血管的生成以及加速肿瘤侵袭和转移。COX-2通过调控缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达抑制细胞凋亡的通路我们课题组前期已做了相关的研究,而多个研究结果发现PKM2在细胞凋亡抵抗中也发挥着重要作用,PKM2是否参与COX-2/HIF-1α通路调控凋亡抵抗尚不清楚。在接下来研究中,我们从分子表达调控层面上探讨在肝细胞癌中PKM2和COX-2、HIF-1α之间的相关性,研究结果提示,在肝癌细胞中,HIF-1α/PKM2参与的调控通路和相关代谢途径的变化,可能起到促进COX-2诱导的细胞凋亡抵抗的作用。放射治疗已成为肝癌局部治疗的主要手段,但临床上存在部分病人肝脏病灶放射治疗敏感性不高,放射治疗后肿瘤退缩不明显的情况,放疗抵抗常见的原因之一就是肿瘤细胞的凋亡抵抗,鉴于前期研究中发现PKM2表达升高引起肝癌细胞的凋亡抵抗,推测PKM2可能与肝癌细胞放疗不敏感有一定的相关性。我们回顾分析了56例接受放射治疗的HCC病人,对于穿刺的病理组织进行PKM2的检测,并对56例HCC患者放射治疗后进行影像学疗效评估,根据疗效评价判断出放疗敏感和不敏感的病人,发现放疗效果不好的病人其病理组织PKM2阳性表达率较高。对3种不同细胞株PKM2的表达量和放射敏感性进行检测,并研究PKM2表达和放疗敏感性之间的关系。下调肝癌细胞系PKM2蛋白表达水平证实,干扰PKM2的表达后,肝癌细胞的凋亡率有明显的升高、放疗敏感性增加,从临床放疗疗效与PKM2的相关性、不同细胞株PKM2的表达和靶向沉默PKM2的细胞株X射线照射后的结果三方面均证明了PKM2不仅可以影响肝癌细胞的凋亡,对肝细胞癌放疗敏感性也有重要的作用。目的:1、了解PKM2对肝细胞癌临床的病理、生化特征和预后的影响。2、探讨肝细胞癌丙酮酸激酶M2（PKM2）异常表达在凋亡抵抗中的作用和分子机制。3、探索肝细胞癌PKM2表达水平与放疗敏感性的关系。方法:1、数据收集从Cancer Genome Atlas和c Bio Portal database下载LIHC的RNA-seq表达和临床数据。所有样本数据均采用Illumina Hi Seq 2000 RNA Sequencing v.2分析获得。然后使用表达定量分析工具RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization）对基因表达值进行统计分析。2、RT-q PCR转染后,使用RT-q PCR评估COX-2、HIF-1α和PKM2 m RNA的表达。使用TRIzol（?）试剂盒提取总RNA。通过使用Nano Drop分光光度计测量260和280nm处的吸光度来评估总RNA浓度。3、蛋白质印迹法和流式细胞术为了检测COX-2、HIF-1α和PKM2蛋白的表达,在转染si-COX-2、si-HIF-1α或si-PKM2后进行western印迹,提取Hep G2细胞中的总蛋白质,使用Lowry蛋白质分析法测定蛋白质浓度。使用Abcam抗体:COX-2、HIF-1α、PKM2和β-肌动蛋白在室温下形成蛋白条带,使用Image J软件通过密度分析对结果进行量化。4、收集肝癌石蜡标本并进行免疫组化染色和组织芯片制备取2001-2007年安徽医科大学第一附属医院肝胆外科手术的肝癌手术标本,用多聚甲醛固定肝细胞癌或癌旁组织24h,流水冲洗固定后的组织过夜后,石蜡经切片、烤片、脱蜡至水、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶、加一抗、二抗,显微镜下观察、拍照。根据芯片微阵列的设计,提前制作TMA受体蜡块待用。病理蜡块切片经HE染色后在光镜下观察。5、原发性肝癌患者的三维适形放射治疗使用真空垫固定患者身体,取仰卧位,在门控系统下进行呼吸调控,呼气系时对患者进行CT模拟扫描,扫描范围自膈顶上至右肾下极范围。据CT扫描的图像确定肿瘤靶区,放疗期间以及放疗结束后6个月内观察患者的放疗效果。6、细胞系的培养和转染Hep G2、BEI-7402、SMMC-7721三种细胞,转染前取对数生长期的细胞,用0.25%胰酶消化,按细胞密度为5×10~5个/孔的浓度接种于6孔板中,待细胞生长密度达到大约65%时,用脂质体Lipofectamine 2000转染质粒和si RNA,转染流程严格根据转染试剂Protocol进行。7、放射敏感性检测将克隆形成消化处理后,不同数量梯度的细胞分别予以0、2、4、6、8 Gy,4种不同剂量进行照射,X线照射后后继续培养10-14 d。对放射处理后的细胞进行固定染色,并计数。克隆形成率（PE）为获得的克隆数所占总接种数的比例。细胞存活分数（SF）既处理组PE与对照组PE的比值;取3次重复的平均值。使用Graph Pad Prism 5.0获得细胞存活曲线,得到平均致死量D0,计算对照组D0与处理组D0值的比。结果1、数据库结果显示,相较PKM2低表达组（＜11.25）,高表达组（≥11.25）的患者具有显著低的肌酐水平（P=0.043）、较高的甲胎蛋白水平（P＜0.001）、临床分期更晚（P＜0.001）以及病理组织分化更差的癌症分级（P=0.004）。同时,PKM2高表达组的患者与PKM2低表达组的患者相比,具有较差的临床预后。校正协变量后,PKM2高表达仍与总生存率降低显著相关（P＜0.05）。2、对144例HCC患者进行PKM2阳性表达率与临床病理及生化因素的相关性分析,结果显示PKM2的表达与γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）（c~2=4.052,P=0.044）、碱性磷酸酶（ALP）（c~2=4.656,P=0.031）、肿瘤大小（c~2=4.197,P=0.041）、病理组织分级（Z=-4.130,P＜0.001）均呈显著正相关。病理分级越高（分化程度越低）的肿瘤,PKM2的表达率越高（低分化表达率为69.2%,高分化表达率为25.0%）,PKM2在大于5cm肿瘤组织中的阳性表达率也较高于小于5cm的组织。3、肝细胞癌组织中环氧化酶-2（COX-2）和PKM2的表达程度显著高于癌旁肝组织（P＜0.05）,COX-2和PKM2的表达均与较差的临床病理特征呈正相关。靶向沉默COX-2基因,显著降低了PKM2和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的m RNA和蛋白的表达量（P＜0.05）,肝癌细胞的凋亡程度显著增加。沉默HIF-1α和PKM2基因可在不抑制COX-2的表达的情况下,增加细胞凋亡的程度。抑制PKM2对COX-2和HIF-1α基因的表达无明显影响。这些结果表明COX-2能够通过调节HIF-1α来调节肝细胞癌中PKM2的表达,肝细胞癌中COX-2通过HIF-1α/PKM2介导的通路激活从而影响细胞的凋亡和增殖。4、56例无法手术的的肝癌病人接受三维适形放射治疗,收集其病理组织进行免疫组化检测其PKM2蛋白表达情况,根据放疗后影像学评估放疗效果,发现PKM2阳性表达的患者其病灶的缓解率（放疗敏感率）明显低于阴性者,PKM2表达阴性的患者无一例放疗后发生进展（P﹤0.05）。5、对3种不同细胞株PKM2的表达量和放射敏感性进行检测,发现PKM2在3种细胞株的表达量由高到低依次为SMMC-7721、BEL-7402和Hep G2。X射线照射处理后细胞克隆数和生存拟合曲线均显示,Hep G2肝癌细胞放疗敏感性最高,BEI-7402次之,SMMC-7721对放射最不敏感,提示PKM2高表达的肝癌细胞株对放疗的敏感性较低,而PKM2表达量低的细胞株对放疗敏感的性相对较高。6、下调肝癌细胞系PKM2蛋白表达水平,肝癌细胞的凋亡率有明显的升高。与单纯放疗相比,RNA干扰PKM2联合放疗显著增加肝癌细胞的凋亡率,差异有统计学意义。结论:1、PKM2可作为肝细胞癌一个独立的危险因素,为今后肝细胞癌发病机制的研究和药物研发提供了有价值的信息。2、PKM2与肝细胞癌的临床病理、生化特征有密切的相关性。3、在肝癌细胞中,HIF-1α/PKM2通路参与COX-2诱导的凋亡抵抗。4、PKM2蛋白高表达可能是导致肝癌病人放疗敏感性下降的重要原因,调控PKM2表达有望成为肝癌放射治疗的新策略。