1.研究背景与目的 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)高发于我国华南地区，尤其是广东省，却在世界大部分地区均为罕见。鼻咽癌的病因学研究表明，鼻咽癌的发生是一个多因素，多阶段的过程，虽然遗传因素和环境因素与鼻咽癌的关系十分密切，但普遍认为EB病毒的感染是引起鼻咽上皮癌变过程的主要因素之一。然而EB病毒与鼻咽癌的关系还远未阐明。大部分研究认为EB病毒在鼻咽癌中处于Ⅱ型潜伏感染状态，但也有少数研究表明在鼻咽癌组织中EB病毒存在一定程度的裂解复制。目前EB病毒与鼻咽癌相关分子机制的研究还主要集中在对于EB病毒潜伏期基因的研究。潜伏膜蛋白LMP1(Latent membrane proteinl)是第一个被发现的EB病毒癌基因，但尽管100％鼻咽癌细胞存在EB病毒基因组，却只有50-60％NPC组织表达LMP1，缺乏LMP1表达的鼻咽上皮细胞同样可以发生恶性转化，提示可能还有其他基因参与鼻咽上皮细胞癌变过程。Cochet C等利用原位杂交的方法检测EB病毒裂解期基因BZIF1(BamHI Z leftward framel)在新鲜鼻咽癌活检组织中的表达发现其mRNA限制性表达于鼻咽肿瘤细胞而不是浸润的淋巴细胞；另外免疫组化的结果显示小部分鼻咽肿瘤细胞可以检测到BZLF1基因的编码蛋白。BZLF1基因位于EB病毒基因组BamHI-Z区域，BRLF1(BamHI R leftward framel)基因和BZLF1基因是EB病毒基因组中位置相邻的两个裂解期立早基因，它们都可以反式激活下游裂解基因启动子从而引发EB病毒的裂解复制，另外，BZLF1和BRF1基因还可以进行交叉转录激活。体外实验表明，BZLF1基因的编码产物Zta蛋白(也称Z，ZEBRA,EB1)在细胞有丝分裂期定位于宿主染色体，Zta蛋白的存在可能会影响染色体浓缩和染色质构象；Zta蛋白还可以上调细胞因子IL-8，增加鼻咽癌细胞的趋化活性；另外，在早期淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines，LCLs)肿瘤中，体内和体外实验均表明由BZLF1或BRLF1基因启动的EB病毒的少量裂解复制可以通过促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成促进肿瘤的生长；但在C18鼻咽癌肿瘤细胞中注入BZLF1或BRLF1的腺病毒表达载体诱导EB病毒进行大量裂解复制时却可以显著抑制裸鼠肿瘤的生长。BZLF1基因在鼻咽上皮细胞癌变的过程中究竟扮演什么角色目前尚不清楚，作为引发EB病毒裂解复制的必需基因，它在EB病毒与鼻咽癌的相关分子机制中可能起着极其重要的作用，对它的深入研究也是非常有意义的。为了深入研究EB病毒与鼻咽癌的关系，本课题组从广东鼻咽癌患者中成功分离一株高致瘤EB病毒亚型GD1并完成其全基因组测序工作，GD1株与原型B95.8株相比，存在43个位点的缺失，44个位点的插入以及1413个位点的变异。GD1株来源于鼻咽癌患者且在广东鼻咽癌患者中具有高度的代表性，它为EB病毒与鼻咽癌相关的分子机制研究提供了较好的模板。 2.研究方法： 2.1 EB病毒GD1型BZLF1基因的突变分析方法： 采集研究对象的漱口水标本并提取DNA，漱口水标本包括：广东鼻咽癌患者192例，广东健康人群197例和河南健康人群128例，另有鼻咽癌组织DNA标本54例，利用巢式PCR方法扩增BZLF1基因的特定片断(每个片断上都分布有多个突变位点)，将PCR产物直接测序，用DNA star序列分析软件分析校读测序结果。分析校读测序结果后筛选出可以得到BZLF1基因序列全长的标本。通过对BZLF1基因编码区的18个变异位点在广东鼻咽癌患者和广东，河南健康人群中的单点变异及多位点连锁变异分布频率的调查分析GD1型BZLF1基因与鼻咽癌的相关关系。 2.2EB病毒GD1型BZLF1基因的功能学研究方法 ①调取GD1型和B95.8原型BZLFl基因的cDNA序列：TPA，丁酸钠联合诱导EBV(+)Akata细胞(查阅文献发现Akata细胞的BZLF1 cDNA序列与GD1型完全一致)和EBV(+)895.8细胞中的EB病毒进入裂解复制周期后提取细胞总RNA，利用RT—PCR方法成功调取Akata细胞以及B95.8细胞中EB病毒BZLF1基因的cDNA序列； ②构建B95.8原型和GD1型BZLF1基因的真核表达载体以及启动子报告基因载体：采用基因重组技术构建荧光标签融合表达载体PEGFP-C1/BZLF1(原型)和PEGFP-C1/BZLF1(GD1型)，真核表达载体peDNA3.1(+)/BZLF1(原型)-6his和peDNA3.1(+)/BZLF1(GD1型)-6hi s。同时构建启动子荧光报告基因载体PGL3BASIC/Zp(BZLF1基因的启动子)和PGL3BASIC/Rp(BRLF1基因的启动子)： ③基因转染及亚细胞定位：利用脂质体转染方法将原型和GD1型BZLF1基因的荧光标签融合表达载体PEGFP—C1/BZLF1(原型)和PEGFP-C1/BZLF1(GD1型)瞬时转染Hela细胞，观察原型和GD1型BZLF1基因的亚细胞定位； ④转录激活能力测定：利用脂质体转染方法共转染BZLF1基因的真核表达载体和启动子荧光报告基因载体，利用双荧光报告基因测定系统分别检测原型和GD1型BZLF1基因的转录激活能力。 ⑤基因转染，细胞因子检测，Westernblot检测及RT-PCR：利用脂质体转染方法将原型和GDI型BZLF1基因的真核表达载体peDNA3.1(+)/BZLF1(原型)-6his和peDNA3.1(+)/BZLF1(GD1型)-6his分别转染人宫颈癌细胞Hela以及鼠成纤维细胞NIH3T3，利用Westernblot方法检测它们对抑癌基因p53以及细胞周期抑制素抑制基因p27，p21蛋白表达水平的影响并利用RT-PCR方法在转录水平上对其进行分析；同时对转染后Hela细胞的培养上清的细胞因子浓度进行检测，观察两者对细胞因子分泌的不同影响； 3.研究结果： 3.1 GD1型BZLF1基因编码区的18个突变位点在广东鼻咽癌患者(组织标本和漱口水标本)和广东健康人群(漱口水标本)的分布频率情况对BZLF1基因编码区的18个突变位点在广东鼻咽癌患者(漱口水和组织标本)和广东健康人群(漱口水标本)中的单点分布频率调查结果显示16个变异位点在广东鼻咽癌患者(包括漱口水和组织标本)中的分布频率远远高于广东健康人群(漱口水标本)，且有显著性差异(P＜0.05)。 3.2 GD1型BZLF1基因在不同人群中的分布情况对广东鼻咽癌患者(漱口水和组织标本)和广东，河南健康人群(漱口水标本)中的BZLF1基因编码区的18个变异位点连锁分析的结果显示GD1型BZLF1基因(18个位点全变异)在广东鼻咽癌患者中的分布频率(漱口水标本：72％；组织标本：77.1％)远远高于广东和河南健康人群(广东，50％；河南，30.2％)，且有显著性差异(P＜0.05)。 3.3 GD1型BZLF1基因功能的初步研究对GD1型BZLF1基因初步的功能学研究结果显示在Hela细胞中，朗病毒GD1型BZLF1基因与原型有相同的核定位，原型和GD1型BZLF1基因均可上调促细胞生长因子IL-6，但GD1型BZLF1基因的作用较原型弱；GD1型BZLF1基因转录激活裂解期基因启动子Zp，Rp的能力也较原型弱；但在Hela细胞和NIH3T3细胞中，GD1型BZLF1基因上调抑癌基因p53以及细胞周期素抑制基因p27蛋白表达的水平强于原型，对p53，p27转录表达水平的分析结果显示GD1型BZLF1基因并不影响两者的转录；但原型和GD1型BZLF1基因都可以提高细胞周期素抑制基因p21的转录水平。 4.结论 4.1对GD1型BZLF1基因编码区的18个变异位点在广东鼻咽癌患者和广东，河南健康人群中的单点变异及多位点连锁变异分布频率的调查结果显示GD1型BZLF1基因在广东鼻咽癌患者中的分布频率远远高于广东和河南健康人群，且有显著性差异，提示GD1型BZLF1基因在广东鼻咽癌患者中具有较高的代表性，它在EB病毒致鼻咽癌的过程中可能起着极其重要的作用。 4.2本研究成功构建了GD1型和B95.8原型BZLF1基因的荧光标签融合表达载体和6His标签真核表达载体，同时还成功构建了EB病毒裂解期立早基因BZLF1和BRLF1基因启动子的荧光报告基因载体，为BZLF1基因进一步的功能学研究奠定了很好的前期研究工作基础。 4.3对GDl型BZLF1基因初步的功能学研究结果显示GD1型Zta蛋白在上皮细胞定位于细胞核，相对原型转录激活裂解基因启动子(Zp，Rp)的能力降低，提示GD1型BZLF1基因启动有效的裂解复制周期的能力可能有所下降；GD1型BZLF1基因在蛋白水平上上调抑癌基因p53，细胞周期抑制素基因p27的作用较原型强，但不影响两者的转录水平，提示GD1型BZLF1基因阻滞宿主细胞周期的作用可能强于原型；另外，GD1型和原型BZLF1基因都可以上调促细胞生长因子IL-6的水平，提示GD1型BZLF1基因可能通过促进细胞生长因子的分泌促进肿瘤细胞的生长。