在开花植物的生活史中,胚胎和胚乳发育是种子形成的重要阶段,为新一代的繁殖奠定了良好开端。由于拟南芥基因组较小、遗传背景清楚、生长周期短、闭花授粉、结实多、植株小、生长环境容易人工控制等多种优点,常被人们用以生长发育基因的调控机理研究,进而拓展到水稻等粮食作物的研究,为增产量、促品质、抗逆性等方面的探究立下了功劳。线粒体不仅是提供能量的细胞器,还参与细胞分裂、生长、分化、以及叶和胚胎等器官形成和发育的调控。线粒体内部有众多蛋白质,已发现有大量的蛋白质参与植物胚胎的发育过程。本文以拟南芥线粒体蛋白TIM22-2的几个突变体为实验材料,采用表型观察、遗传转化、活体胚胎分离、q RT-PCR、免疫沉淀、质谱分析等多种分子生物学、细胞生物学和遗传学实验技术,对编码拟南芥TIM22-2蛋白的基因进行相关功能研究,发现其在胚胎发育和线粒体蛋白运输过程中发挥着重要功能。获得的主要结果如下:1.从拟南芥突变体库ABRC中获得了TIM22-2基因的相关T-DNA插入突变体,分别为tim22-2-1和tim22-2-2。突变体tim22-2-1的插入位点为第2个外显子,该突变体的胚胎表型为大多数胚胎停滞于球形期而不能继续发育。突变体tim22-2-2的T-DNA插入位点在第1个外显子上,该突变体的胚胎最早停滞在球形胚胎时期,而最晚可发育为子叶期,形状均有不同程度的异常。为了探索突变位点的不同是否会影响相应突变体的表型,进行了CRISPR-Cas9基因编辑并获得了目的基因的转基因突变体tim22-2-cr,其中一个突变体设计的编辑位点在第2个外显子上,命名为tim22-2-cr3。突变体tim22-2-cr3两个株系的所有角果中都有白化的胚珠,即产生胚珠败育的表型,测序检测其序列编辑情况发现,一个株系不存在编辑,另一个株系部分叶片中有编辑,编辑方式为第566位碱基之前插入一个碱基A、567位的碱基T突变为G;由于该突变体的两个株系都为常见的嵌合体植株,未对它们继续观察。然而,对第一个外显子上编辑的突变体tim22-2-cr1进行筛选后,获得了编辑位点稳定遗传的植株,其编辑方式为第169位碱基T突变为C,第191位碱基C缺失。对突变体tim22-2-cr1胚珠进行透明观察,发现其胚胎表型与tim22-2-1非常相似。种子发育的另外一个重要研究对象为胚乳,因此,对突变体的胚乳也进行了荧光观察。与野生型相比,授粉后5天,tim22-2-cr1和tim22-2-1突变体胚乳核都未正常细胞化,且tim22-2-1突变体的胚乳核数目减少、体积膨大。tim22-2-2突变体胚乳一部分正常发育而另一部分发育迟缓、未正常细胞化。结合胚胎和胚乳的表型特征,推测TIM22-2基因在拟南芥种子发育中具有重要的作用。2.构建TIM22-2基因启动子融合GUS载体并遗传转化,对转基因材料进行组织染色并观察,发现GUS信号在幼苗、叶片维管组织、顶端分生组织、花柱、花丝和花序均显著表达,表明TIM22-2基因在营养器官和生殖器官中均广泛表达。在目的基因启动子下游引入GFP标签后,观察到不同时期的胚胎均具有荧光信号,这暗示着TIM22-2基因参与胚胎发育。对TIM22-2蛋白进行亚细胞定位实验,以两周的p TIM22-2-CDS-GFP转基因幼苗为实验材料提取原生质体,并用Mito Tracker染色剂荧光定位线粒体,用GFP荧光定位TIM22-2蛋白,研究发现这两个荧光信号均能共定位于线粒体上,明确该蛋白是一个线粒体蛋白。为了证明亚细胞定位载体上的GFP标签未对目的蛋白的表达造成影响,还用此载体成功回复了tim22-2-2突变体,结果发现在纯合突变体的角果中无败育的种子。3.利用胚胎特异基因ABI3启动子驱动TIM22-2基因CDS,构建载体并遗传转化,使突变体的败育表型得到了部分回复,获得了部分回复纯合突变体tim22-2-2p ABI3::TIM22-2CDS植株。这一纯合突变体的种子能够发育成熟,萌发成幼苗,并顺利开花;但是,植株产生角果后,角果长度变短、较细、胚珠未发育,故而无法繁殖下一代。然而,部分回复纯合突变体植株仍为该基因深层面的研究获得了有价值的遗传材料。用3-4周的拟南芥p35S::TIM22-2-HA幼苗诱导愈伤组织,提取线粒体蛋白,目的是利用免疫沉淀（IP）技术搜寻可能与TIM22-2互作的蛋白。通过IP样品的质谱检测后,对获得的样品进行生物信息学分析,共发现3444个蛋白,其中533个为线粒体蛋白,分别为30个外膜蛋白、53个内膜蛋白、31个基质蛋白、3个膜间隙蛋白、以及416个无具体定位的线粒体未知蛋白。因此,主要对这117个已知具体定位的线粒体蛋白进行分析,其中B14.7、TIM17-2、TIM23-2与TIM22-2都为PRAT（Preprotein and amino acid transporter,前体蛋白和氨基酸转运蛋白）家族成员;TIM44-2和TIM50均为TIM23蛋白复合体亚基;AT5G27395是一个与TIM22-2高度共表达的蛋白;TIM9是膜间隙中的一个小分子伴侣亚基。这些拟南芥线粒体蛋白的发现,为人们对于植物线粒体蛋白以及其运输途径的进一步研究提供了重要信息。4.构建p35S::TIM23-2-HA载体并获得了拟南芥纯合转基因植株,用两周幼苗提取RNA,通过检测发现TIM23-2目的基因的表达水平显著上升,证明了HA标签未对TIM23-2蛋白的功能造成影响。利用CRISPR技术构建了AT5G27395、TIM17-1、TIM23-2基因编辑载体,用以研究目的基因的生物学功能。