目的第一部分:探讨不同浓度梯度顺铂（Cisplatin,DDP）溶液培养下的膀胱癌细胞凋亡情况和miR-141表达含量的差异性及分析。第二部分:探讨顺铂通过下调miR-141表达促进膀胱癌细胞凋亡的分子机制,从miR-141与沉默信息调节因子1（Sirt1）调控关系的角度进行阐述,以期为临床检测及治疗膀胱癌提供帮助。方法第一部分:选择膀胱癌T24细胞株进行培养,选取第三代生长细胞作为研究对象;将其分成以下几组:Control组（添加等量PBS缓冲溶液）;H-DDP组（高剂量组,50μmol/L DDP培养24小时）;M-DDP组（中剂量组,20μmol/L DDP培养24小时）;L-DDP组（低剂量组,10μmol/L DDP培养24小时）;利用实时荧光定量核酸扩增检测系统（RT-PCR）检测上述各组细胞miR-141的表达水平;MTT检测各组细胞增殖情况;Transwell检测细胞侵袭情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;DNA倍体检测细胞周期;线粒体跨膜电位检测线粒体电位;透射电镜检测细胞器变化,并做出相应的统计分析。第二部分:在第一部分分组的基础上,Control组（等量PBS）,H-DDP组（50μmol/L DDP培养24小时）,M-DDP组（20μmol/L DDP培养24小时）,L-DDP组（10μmol/L DDP培养24小时）,应用重组质粒的方法展开以下研究:RT-PCR检测各组细胞中Sirt1、促细胞凋亡基因Bax及抑细胞凋亡基因Bcl-2的mRNA水平变化情况;双萤光素酶实验检测Sirt1与miR-141的调控关系;Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2、Sirt1以及其调节的p53、FOXO1及β-catenin的表达情况,阐明顺铂促进膀胱癌细胞凋亡的分子机制。结果第一部分:RT-PCR检测分析:图中具有三条明显的条带,从上到下分别为rRNA 28S、rRNA 18S和rRNA 5S,所提样品未发生降解且结构完整。数据提示对照组miR-141条带浓度最大最亮,在顺铂的干预下,条带的颜色逐渐变暗,且随着浓度的增加,条带的灰暗性愈明显。各样品总RNA的OD值通过微量核酸检测仪检测获取,结果显示各样品的A260/280的比值均在标准范围内,表明各样品所提取的总RNA质量满意,数据具有一定的可靠性。各样品中miR-141和内参基因U6之间的溶解曲线呈现出特异性单峰,充分表明所用的扩增引物无其它异物二聚体或者其它非特异性扩增过程。在对各组膀胱癌T24细胞表达含量的统计分析中,各组细胞中2^-ΔΔCt数值大小比较为H-DDP组<M-DDP组<L-DDP组<Control组,各组之间进行数据比较,发现P<0.05,差异具有统计学意义。HE染色分析:对照组细胞整体上数量较多,密度较大,细胞周围的血管以及绒毛数量较多,膀胱癌细胞的凋亡趋势较弱。在顺铂充分干预下,细胞的形状逐渐不规则,整体密度低,细胞空隙较大,充斥较多组织液,细胞多是不规则的多边形。随着顺铂溶液浓度的增加,细胞的密度逐渐降低,细胞周围的空隙逐渐增大,由规则的立方形逐渐变成不规则的多边形,提示细胞凋亡趋势严重。MTT检测分析:随着时间的延长,各组细胞的细胞增殖趋势逐渐降低,对照组整体变化较小,肿瘤细胞增殖趋势较平稳。在顺铂的充分干预下,各组膀胱癌T24细胞增殖情况逐渐受到抑制,细胞增殖的趋势逐渐降低。Transwell检测细胞侵袭:各组细胞之间侵袭比较为H-DDP组（18.68±6.46）个<M-DDP组（23.56±7.21）个<L-DDP组（34.70±7.88）<Control组（53.44±12.09）个,高中低剂量组均明显小于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。线粒体膜电位分析:对照组细胞的线粒体跨膜电位异常性最明显,整体上为绿色荧光,线粒体膜电位变化差异性较大,随着顺铂浓度变化,膀胱癌T24细胞整体趋化正常性明显,线粒体膜电位正常性逐渐明显,逐渐由纯绿色向黄绿色过度,当顺铂浓度最高时,细胞线粒体膜电位颜色为黄绿色单体模式。Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:各组比较为Control组（0.78%）<L-DDP组（5.25%）<M-DDP组（13.14%）<H-DDP组（21.25%）,随着顺铂浓度增加,细胞凋亡趋势逐渐增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞周期检测:各组膀胱癌T24细胞处于S期的对比分析为H-DDP组（25.38%）<M-DDP组（30.46%）<L-DDP组（39.80%）<Control组（43.45%）,差异具有统计学意义（P<0.05）;G2/M期细胞所占比例分析为H-DDP组（6.38%）<M-DDP组（12.46%）<L-DDP组（18.80%）<Control组（23.45%）,差异具有统计学意义（P<0.05）。透射电镜分析:对照组细胞内部出现一定程度脂质沉淀,细胞内明显可见许多空泡现象,细胞内部出现明显突起,高尔基体和线粒体等均呈现出肿大现象。随着顺铂溶液的充分干预,膀胱癌T24细胞内部病变程度降低,并且呈现出剂量依赖性特征,细胞内部空泡现象逐渐减少,初级溶酶体、次级溶酶体甚至是吞噬体数量亦逐渐减少,线粒体体积趋于正常性。第二部分:双萤光素酶实验检测分析:miR-141在Sirt1的UTR区域之间存在较多的碱基互补对,可见二者之间具有一定的关联性,并且存在一定的调控关系。miR-141抑制剂与其重组质粒共转染的膀胱癌T24细胞,明显提高了野生型Sirt1 3’UTR的活性,突变型Sirt13’UTR的活性却表现平稳,差异具有统计学意（P<0.01）;miR-141激动剂与其重组质粒共转染的膀胱癌T24细胞,可以明显的降低野生型Sirt1 3’UTR的活性,其突变型Sirt1 3’UTR的活性却得到提高,差异具有统计学意义（P<0.01）。Western-blot检测分析:Bax、Caspase-3表达趋势为Control组<L-DDP组<M-DDP组<H-DDP组,各组之间比较差异具有统计学意义（P<0.01）;Sirt1浓度表达关系为Control组<L-DDP组<M-DDP组<H-DDP组,各组之间比较差异具有统计学意义（P<0.01）。Sirt1浓度表达:Control组（0.19±0.04）<L-DDP组（0.43±0.12）<M-DDP组（0.93±0.34）<H-DDP组（1.26±0.56）,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）;Bax及Caspase-3浓度表达:Control组<L-DDP组<M-DDP组<H-DDP组,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）;Bcl-2浓度表达:H-DDP组（0.46±0.18）<M-DDP组（0.73±0.25）<L-DDP组（0.94±0.35）<Control组（1.21±0.34）,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）;p53浓度表达:H-DDP组（0.58±0.14）<M-DDP组（0.83±0.25）<L-DDP组（1.34±0.40）<Control组（1.66±0.56）,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）;FOXO1浓度表达:H-DDP组（0.38±0.09）<M-DDP组（0.47±0.20）<L-DDP组（1.15±0.23）<Control组（1.17±0.36）,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）;β-catenin浓度表达:H-DDP组（0.32±0.10）<M-DDP组（0.43±0.22）<L-DDP组（1.13±0.23）<Control组（1.20±0.28）,各组之间数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）。Western-blot检测分析提示顺铂可剂量依懒性下调Bcl-2、β-catenin、FOXO1,上调Sirt1、Bax、Caspase-3。结论（1）顺铂可下调miR-141在膀胱癌T24细胞中的表达,并可抑制细胞增殖、降低细胞侵袭能力、促进膀胱癌细胞的凋亡效应,且呈浓度依赖性,其机制可能与改变线粒体膜电位及改变细胞内部结构有关。（2）Sirt1是miR-141直接调控靶基因之一,二者呈现负反馈调节,Sirt1在膀胱癌的发生发展过程中扮演了重要角色。miR-141下调可以抑制膀胱癌细胞的增殖,促进凋亡,Sirt1可以促进膀胱癌细胞的凋亡;顺铂与靶基因Sirt1体现出正反馈趋势,二者共同促进膀胱癌细胞的凋亡过程,同时对其细胞核内DNA转录关键因子FOXO1、p53以及细胞凋亡通路关键蛋白β-catenin等均有一定的调控性,具有一定的临床实践意义。