研究背景脑卒中严重危害人类健康,在全世界范围内是主要的致死和致残性疾病。由于老龄化人口的不断增加和危险因素的增加,目前全球范围脑卒中的负担越来越重。在脑卒中病人中,缺血性脑卒中占到60-70%。静脉溶栓和血管内介入治疗是针对缺血性脑卒中有效的治疗方法。尽管近年来缺血性脑卒中血管再通治疗有了较大发展,血管再通治疗了的干预时间窗有了进一步延长,但是能够在较短治疗时间窗内接受静脉溶栓治疗和血管内介入治疗的病人比例仍然较低。即使是能够接受血管再通治疗的病人,如何处理血管再通后再灌注继发的脑损伤仍然是一个棘手的问题。因此目前针对缺血性脑卒中后脑损伤仍需探索新的治疗方法。炎症反应在缺血性脑卒中后神经损伤的过程中起着重要的作用。越来越多研究证据显示调节缺血性卒中后机体内淋巴细胞的分化对卒中后脑损伤有潜在的干预作用。有研究显示,在T淋巴细胞中调节性T淋巴细胞(Tregs)在缺血性脑卒中后能够起到神经保护作用,而其主要的作用机制可能与Tregs抑制卒中后炎症反应有关。因此增加Tregs的比例可能是治疗缺血性脑卒中有效的有效途径。干细胞治疗是目前针对卒中引起神经损伤的一种有希望的治疗方法。近年来研究者发现脐带血来源的多能干细胞(human cord blood-derived multipotent stem cells,HCB-SCs),在卒中治疗中能起到改善神经功能,减少梗死体积及延长生存期的作用。并且,越来越多的研究证据显示HCB-SCs能够通过调节Tregs起到调节免疫反应的作用。我们前期的研究中发现当外周淋巴细胞与HCB-SCs共培养后,能够增加外周淋巴细胞中Tregs的细胞比例。采用与HCB-SCs共培养后的淋巴细胞移植能够通过免疫调节途径减轻APP/PS1转基因小鼠动物模型的病理改变。鉴于HCB-SCs和Tregs对缺血性脑卒中的治疗潜能,在本研究中我们采用大鼠的脾脏淋巴性细胞在体外与HCB-SCs共培养,将共培养后的淋巴细胞通过静脉注射途径移植到短暂性大脑中动脉缺血(tMCAO)的大鼠动物模型体内,并观察这种淋巴细胞移植的方法对缺血性脑卒中脑组织的神经保护作用并探讨其调节缺血性脑卒中炎症反应的机制。研究方法1.实验动物研究选用雄性Wistar大鼠,体重在250-300g,实验动物购于山东大学齐鲁医学部实验动物中心。实验大鼠饲养于22℃,12小时明暗交替的实验动物饲养环境中,可自由获取食物和水。研究方案经过山东大学医学院伦理委员会批准。所有动物实验均按照“山东大学实验动物护理使用指南”进行。将大鼠随机分为3组:假手术组(Sham,n=10);短暂性大脑中动脉闭塞再灌注组(tMCAO,n=12);tMCAO联合与HCB-SCs共培养的培养淋巴细胞移植组(tMCAO+LT,n=12)。2.制备短暂性大脑中动脉闭塞再灌注组(Transient Middle Cerebral Occlusion,tMCAO)动物模型采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。采用颈正中腹侧切口,分离皮下组织,分离左侧颈总动脉血管。将直径0.28 mm的圆头锦纶丝作为线栓从颈总动脉腔内导入颈内动脉,阻断左侧大脑中动脉(Middle Cerebral Artery,MCA)的开口。将左侧MCA用线栓闭塞90min,将线栓抽出,使MCA再灌注。假手术组经左侧颈部切口显露动脉,但未将线栓插入颈内动脉。3.淋巴细胞共培养和移植HCB-SCs的制备和脾脏淋巴细胞的制备过程与我们之前研究报道的过程一致。用于研究的人类脐带血采集方法经过了山东大学和济南中心医院机构伦理评审委员会的批准。取得献血者的知情同意后收集来自济南市中心医院产科健康献血者胎盘的脐带血样本。用异氟醚(浓度2-5%,流量2 L/min)麻醉Wistar大鼠,取脾脏。应用淋巴细胞分离液分离大鼠脾脏淋巴细胞,与HCB-SCs在体外按10:1比例共培养3天。共培养后收集淋巴细胞,调整细胞浓度为2×1 07个细胞/mL。分别在缺血再灌注造模2小时和24小时后,通过尾静脉注射,将体外与HCB-SCs共培养的淋巴细胞输注入大鼠体内。每只实验组大鼠静脉输注淋巴细胞数量为1×107/500 μL生理盐水。假手术组及对照组tMCAO大鼠经尾静脉注射不含淋巴细胞生理盐水。所有实验动物不给予免疫抑制药物处理。4.神经功能缺损的检测(1)改良的Bederson’s测试行为测试采用改良的Bederson’s测试。在实验动物缺血再灌注处理48小时后,大鼠悬吊于离实验台上方20-30 cm处。按照如下神经功能障碍的评分标准:0分,大鼠伸直双前肢,无明显的神经功能缺损症状;1分,大鼠一只前肢贴胸,另一只前肢伸直,损伤麻痹一侧不能完全伸展前爪;2分,大鼠对侧推阻力下降,向损伤麻痹的一侧轻推大鼠出现抵抗力下降,但是并没有出现回旋;3分,大鼠对侧推阻力下降,向损伤麻痹的一侧轻推大鼠出现旋转;4分,大鼠失去自主行走动作或者意识。(2)胶带移除实验在tMCAO后48小时进行胶带去除试验以评估前爪感觉运动障碍。大鼠置于大小约为60cm×50cm盒内。迅速的将2个长度相等(大小约113 mm2)的胶粘带快速附着在大鼠的2个前肢远端桡侧区域,然后将大鼠被放到盒子内。记录实验大鼠从前肢上取下胶带的时间。对一只大鼠进行三次测试,取中位数进行统计。如果一只实验大鼠不能在180秒内移除前肢的两条胶带,那么最后记录的时间就是180秒。每只大鼠在进行tMCAO造模手术前进行胶带移除训练3天。5.脑梗死体积的测量tMCAO造模再灌注48小时,完成行为学检测后,用10%水合氯醛深度麻醉大鼠。大鼠断头取脑,大脑组织切成2.0毫米厚的冠状切片。大脑切片立即在加入2%三苯基四唑氯铵(TTC)的0.9%生理盐水中37℃摄氏度孵育30分钟。之后脑组织切片转移到4%多聚甲醛溶液中固定12小时。扫描仪拍摄脑切片照片。图像用Image-Pro Plus 6.0软件分析梗死区域。各切面梗死面积为两侧面积之和的平均值。计算每只动物的梗死体积,取平均切片厚度(2mm)的乘积,并将所有脑切片的梗死面积相加。结果以梗死体积占总脑组织体积的百分比表示。6.流式细胞仪检测实验各组大鼠外周血经内眦角静脉采血,静脉用肝素钠管收集。4℃(1000rpm,30min)离心后,收集上清血浆,-80℃保存,待检测。应用鼠淋巴细胞离心分离液(索莱宝公司)分离大鼠外周血淋巴细胞进行下一步检测。洗涤后,按照抗体试剂说明,将细胞与抗体在4℃下孵育。实验检测所使用抗体包括抗大鼠FITC结合的CD4抗体、抗大鼠AF647结合的CD25抗体和抗大鼠PE结合的Foxp3抗体。以上这些抗体购自BioLegend公司。细胞固定和染色方法参照抗体试剂制造商的说明。所有标本均用流式细胞仪分析(Beckman CytoFLEX),进程结果采用使用FlowJo VX软件分析。7.TUNEL 染色使用原位一步法免疫荧光法检测TUNEL凋亡试剂盒(Beyotime Biotechnology,China),按照说明书进行操作。荧光显微镜下观察到CY3标记的TUNEL 阳性细胞。红色荧光细胞被定义为凋亡细胞。为了量化凋亡细胞,我们分析了每只动物的3片缺血大脑皮层。使用Image Pro Plus软件,在200×放大倍数下,测量每个切片5个视野的凋亡细胞数量。6.Western blot 检测每组取4只大鼠的脑组织按照大脑中动脉供血区域分离梗死一侧大脑半球皮层(包含梗死核心区域和缺血半暗带)。用含有1%蛋白酶抑制剂(氟化钠)和1%磷酸酶抑制剂(原钒酸钠)的RIPA裂解缓冲液提取蛋白,整个过程在冰上操作。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。在聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上电泳分离每个样品中的蛋白,然后蛋白样本转移到PVDF膜上。应用蛋白转膜后PVDF膜在封闭液(5%脱脂奶粉)中孵育1小时,之后与含有相应一抗抗体的缓冲液在4℃孵育过夜。主要选用的抗体包括NF-κB p-P65一抗(Cell Signaling),NF-κB P65一抗(Cell Signaling),p-ERK一抗(Cell Signaling),ERK一抗(Cell Signaling),NLRP1一抗,NLRP3一抗,caspase-1一抗(Abcam),IL-1β一抗(Abcam)裂解caspase-3一抗(Cell Signaling),和β-actin一抗(Cell Signaling)。抗体孵育后用 TBST 缓冲溶液冲洗三次(每次5分钟),之后将PVDF膜与相应的二抗在室温下孵育1小时。PVDF膜用TBST缓冲盐水冲洗,凝胶成像系统(Protein Simple,FluorChem Q)扫描,利用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析,定量蛋白水平。分析过程采用p-P65 NF-κB和p-ERK(MAPK)分别与总的P65 NF-κB和ERK(MAPK)的比值表示NF-κB和ERK信号通路的激活情况。对于蛋白caspase-1、IL-1β3、NLRP3炎性小体蛋白,NLRP1炎性小体蛋白和caspase-3是以β-actin作为内参分析。7.统计分析数据分析使用GraphPad Prism 6软件进行。数据用均数±标准误表示。数据的统计分析采用单因素方差分析(oneway ANOVA),各组之间比较采用Student-Newman-Keuls分析方法。P<0.05被认为是差异具有统计学意义。研究结果1.与HCB-SCs共培养的培养淋巴细胞移植(LT)处理减轻缺血性脑卒中后神经损伤两名观察人员在再灌注48小时后以盲法评估每只动物神经功能缺损情况。通过评估测试结果显示,tMCAO组和tMCAO+LT组动物tMCAO术后2小时行为评分无显著性差异。缺血性脑卒中恢复再灌注48小时后,与假手术组相比,tMCAO组大鼠出现严重的神经功能损伤表现(P<0.05)。LT处理显著降低了 tMCAO大鼠再灌注48小时后的神经功能障碍评分(P<0.05)。通过胶带移除实验检测大鼠感觉运动功能缺损情况。实验结果如图1B所示,假手术组在假手术48小时后,大鼠将前肢胶带移除的延迟时间为9.9±0.924 s。与假手术组相比,tMCAO手术组实验动物的胶带移除时间分别为tMCAO对照组(139.3±9.996 s),tMCAO+LT组(103.7±11.87 s),这一结果显示在缺血再灌注后48小时后tMCAO造成大鼠明显的感觉运动功能受损,胶带清除延迟时间明显延长(P<0.05)。LT处理显著降低tMCAO大鼠胶带清除延迟时间(P<0.05)。2.LT处理减少tMCAO大鼠脑梗死体积采用TTC染色法显示缺血性脑卒中后梗死区域,计算大脑切片梗死体积。与假手术组相比,tMCAO手术后大鼠再灌注48小时后梗死体积明显增大(P<0.05)。与tMCAO对照组相比,tMCAO+LT组大鼠梗死体积明显缩小(P<0.05)。3.LT处理可调节tMCAO大鼠外周淋巴细胞内Tregs亚群的分化为了评价LT处理对tMCAO大鼠免疫应答的影响,我们从外周血中分离淋巴细胞细胞,通过流式细胞术分析Tregs的比例。如图3A和C所示,我们观察到tMCAO后48小时大鼠总的Tregs(CD4+CD25+)的百分比明显升高(P<0.05),而LT处理并没有改变tMCAO大鼠总的CD4+CD25+Tregs的百分比。与Sham组相比,tMCAO组大鼠外周血tMCAO后48h CD4+CD25+Foxp3+Tregs亚群的比例明显升高,LT处理进一步提高了 tMCAO组大鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的比例(P<0.05)。4.LT处理可减轻炎性小体的活性在这项研究中,我们检测了 LT处理对tMCAO大鼠缺血性脑卒中后神经炎症反应的影响,并且检测了 caspase-1、IL-1β、NLRP1和NLRP3几个目前已知的主要炎性小体信号通路相关蛋白质在tMCAO大鼠术后48小时损伤一侧大脑皮质中表达的情况。蛋白质免疫印迹法检测结果表明tMCAO手术后小时后48损伤测脑组织皮层内caspase-1、IL-1β、NLRP1和NLRP3表达量与Sham组相比显著增加(P<0.05)。LT处理方法可以显著降低损伤侧脑组织皮层内caspase-1、IL-1β3和NLRP3(P<0.05)。但LT处理对tMCAO大鼠NLRP1表达无明显影响(P>0.05)。5.LT处理通过影响ERK和NF-κB信号通路调节免疫应答在本研究中显示LT处理能够影响脑组织细胞内NF-κB和ERK信号通路的激活。我们的研究结果表明tMCAO手术48小时后在大鼠损伤侧脑组织内p-ERK/总ERK和p-NF-KB(P65)/总NF-κB(P65)的比例较Sham组显著增加(P<0.05)。LT处理能够降低p-ERK/总ERK和p-NF-KB(P65)/总NF-κB(P65)的比值(P<0.05)。这一结果表明LT处理治疗可以减少NF-κB(P65)和ERK的磷酸化,从而抑制ERK和NF-κB信号通路的激活。6.LI处理可以减轻tMCAO损伤诱发的神经细胞凋亡为了研究LT处理对tMCAO继发脑损伤造成的细胞抗凋亡的影响,我们采用Western blot检测cleaved caspase-3片段的表达水平。结果显示,tMCAO组cleaved caspase-3蛋白水平高于Sham组(P<0.05)。LT处理可显著降低tMCAO大鼠cleaved caspase-3水平(P<0.05)。为了进一步研究LT处理对神经元凋亡的影响,我们采用TUNEL染色法分析缺血大脑皮层凋亡细胞的数量。结果显示tMCAO相比与Sham组相比缺血损伤侧大脑皮层内凋亡细胞的数量明显增加(P<0.05,图5)。LT处理能够显著减少缺血大脑皮质细胞凋亡细胞的数量(P<0.05),这表明与HCB-SCs共培养的淋巴细胞的移植方法能够通过减轻tMCAO引起的细胞凋亡起到保护神经细胞减的作用。结论我们前期研究已证实与HCB-SCs共培养可以调节淋巴细胞中Tregs细胞比例,并起到调节免疫炎症反应的作用。因此探讨与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植可以为缺血性脑卒中的脑保护治疗探索新的途径。本研究结果显示:1.与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植能够改善缺血性脑卒中tMCAO大鼠模型神经功能缺损症状,缩小脑梗死体积。2.与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植能够提高tMCAO大鼠模型外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的比例,抑制缺血性脑卒中后炎症反应。3.与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植能够通过抑制tMCAO大鼠脑内NLRP3炎性小体信号通路的活化及IL-1β的生成,起到调节缺血性脑卒中后脑内炎症反应的作用。4.与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植能够通过抑制tMCAO大鼠缺血脑组织内细胞凋亡,起到神经保护作用。综上所述与HCB-SCs共培养的淋巴细胞移植具有干预tMCAO大鼠脑缺血后神经炎症反应变化的潜能,是一种卒中后脑保护治疗的新途径。