研究背景近年来,随着人们生活水平的逐步提高以及人口老龄化的到来,糖尿病的发病率在全球范围内呈快速增长的发展趋势,我国已经成为全球糖尿病的第一大国。糖尿病是在环境与遗传因素相互作用下,导致的胰岛素分泌不足伴或不伴胰岛素抵抗,从而引发的一组代谢紊乱性疾病,以慢性血糖升高为特征。长期慢性的血糖升高可使一些器官或组织发生结构及功能的改变,导致各种并发症的发生,严重影响人们的生活质量。大血管病变是糖尿病的主要慢性并发症之一。在糖尿病患者中,冠心病、脑血管疾病以及外周血管疾病等大血管并发症的发病率较非糖尿病患者明显升高,已经成为糖尿病患者致死、致残的首要原因。糖尿病大血管病变主要表现为冠状动脉、主动脉等大、中型血管的动脉硬化,几乎超过半数的糖尿病患者最终会并发大血管病变,这些血管的损害是糖尿病并发心脑血管疾病的病理基础。糖尿病患者的动脉硬化相比非糖尿病患者,其发病率高,并且发病年龄早,病情进展也快,其中80%的糖尿病患者死于心血管并发症,所以,从某种意义上说糖尿病又是一种心血管疾病,糖尿病是冠心病的“等危症”。糖尿病的发病机制涉及多个方面和因素,与遗传易感性、糖脂代谢异常以及氧化应激等密切相关,但其确切机制还尚未完全明了。研究表明,严格控制血糖可明显降低糖尿病微血管并发症的发生和发展,但却未被证明与糖尿病大血管病变之间的确切和必然的联系。高血糖是否是糖尿病大血管并发症的直接原因,强化降糖本身是否可以减少糖尿病大血管病变的发生与发展,这些问题至今还尚无定论。英国前瞻性研究证实,强化血糖控制并不能有效预防糖尿病大血管病变的发生。因此,除控制血糖之外,进一步研究糖尿病大血管病变的发病机制及相关干预措施是非常必要的。研究发现,高同型半胱氨酸(Hcy)水平与糖尿病密切相关,是糖尿病大血管并发症发生发展的一个独立危险因素。Hcy是一种含巯基氨基酸,其自由巯基极易发生自身氧化的同时,产生大量的过氧化氢和其它氧自由基,进一步增强高血糖的直接毒性作用以及氧化修饰后葡萄糖对内皮细胞的损伤,促进血小板聚集和平滑肌细胞增生,导致动脉粥样硬化及血栓的形成,从而与糖尿病大血管病变显著相关。同时,糖尿病患者存在明显的无氧酵解,组织及细胞长期处于缺氧状态与糖尿病慢性并发症的发生关系密切。血糖的升高,致使醛糖还原酶的活性明显增加,细胞内大量山梨醇及果糖不断积聚,导致细胞缺氧加重,而缺氧又进一步促使机体通过升高血糖来平衡缺氧导致的能量代谢障碍,两者交错在一起,形成恶性循环,最终导致糖尿病病情的进展及并发症的出现。研究发现,高糖环境本身及微血管的病变均可造成组织细胞的缺氧,导致乏氧诱导因子-1α (HIF-1α) mRNA表达的增加。HIF-1α可通过诱导动脉硬化斑块内的血管生成,增加斑块的不稳定性。HIF-1α与糖尿病慢性并发症的发生关系密切。传统观念认为,高血糖导致的糖尿病慢性并发症主要是通过以下四条途径实现的：蛋白激酶C通路(PKC通路)、多元醇通路、非酶糖基化终末产物(AGEs)的形成和氨基己糖通路等。然而,近年来大量的研究证实,氧化应激与糖尿病大血管并发症的发生和发展关系密切,可能是上述四条病理性通路的共同机制,在糖尿病大血管并发症的进程中扮演着极其重要的角色。因此,拮抗氧化应激对糖尿病大血管并发症的防治具有极其重要的意义,如何在降低血糖的同时调整糖尿病患者体内的氧化应激状态成为糖尿病大血管病变治疗的新思路。大蒜素是从大蒜的球形鳞茎中分离出的一种含硫化合物,是大蒜的有效成分之一。实验证明,大蒜素具有调节血糖、抗血小板聚集、降低胆固醇、抑制肿瘤发生等多种生物活性,其中,调节血糖、抑制脂质过氧化与清除自由基的作用引起了更多的重视。我们既往的研究发现,大蒜素能明显降低糖尿病大鼠的血糖及高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠血浆Hcy的水平,并且能够降低高Hcy培养内皮细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的生成,减少Hcy对内皮细胞的损害作用,还能够抑制兔血管平滑肌细胞的增殖,下调c-myc mRNA的表达。然而,大蒜素对糖尿病的大血管是否有保护作用,目前国内外报道极少。因此在本研究中,我们应用大蒜素干预糖尿病合并高同型半胱氨酸血症的患者,观察糖化血红蛋白、血Hcy以及颈动脉内中膜厚度(IMT)的变化,并且进行细胞培养,采用小鼠主动脉内皮细胞,应用高糖、高Hcy及乏氧条件体外模拟糖尿病的内环境,给予大蒜素干预,观察细胞内活性氧(ROS),还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶,8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)等氧化应激相关指标的变化,以及对细胞内PKC信号通路的影响,以阐明大蒜素对内皮细胞保护作用的可能机制,为大蒜素用于糖尿病大血管病变的临床防治提供理论依据。研究目的1、观察大蒜素对糖尿病高同型半胱氨酸血症患者的治疗效果,包括糖化血红蛋白,血Hcy水平以及颈动脉内膜中层厚度(IMT)的变化.2、观察大蒜素对高糖高Hcy条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用并探讨作用机制。3、观察大蒜素与Hcy在接近人体的温度及PH条件下的反应。4、观察大蒜素对高糖乏氧条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用并探讨作用机制。研究方法一、大蒜素对糖尿病合并高同型半胱氨酸血症患者治疗的临床观察1、实验设计：采用随机对照法将入选患者分为两组,每组20例,应用门冬胰岛素及甘精胰岛素皮下注射控制血糖,对照组同时给予阿托伐他汀钙片一次20 mg,一日1次睡前口服治疗；大蒜素治疗组在加用阿托伐他汀钙片治疗的基础上,给予大蒜素胶囊一次40mg,一天3次口服,为期3个月。2、检测指标：治疗前测糖化血红蛋白、血Hcy、血脂、肝肾功能等生化指标,检测颈动脉IMT。治疗后每月测定患者的肝肾功能及肌酸激酶,若转氨酶升高达正常上限值3倍、血肌酐升高超过正常上限值20%或肌酸激酶达到正常上限值2倍者终止治疗。3个月后复测糖化血红蛋白、血Hcy及颈动脉IMT的变化。3、统计学处理：实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,各组计量资料数据均采用均数±标准差(x±s)表示。治疗前后及两组间样本比较采用t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。二、大蒜素对高糖高Hcy条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用机制1、细胞培养及处理：采用小鼠主动脉内皮细胞,37℃、5% CO2培养箱内,内皮细胞培养基(ECM)培养及传代,第三代细胞用于实验,待细胞生长至对数生长期,将细胞随机分为5组：①正常对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L的无血清ECM培养液培养),②甘露醇组(甘露醇浓度25mmol/L的无血清ECM培养液培养),③高糖高Hcy组(葡萄糖浓度25mmol/L+Hcy浓度1mmol/L的无血清ECM培养液培养),④大蒜素组(大蒜素浓度10μg/mL+葡萄糖浓度25mmol/L+Hcy浓度1mmol/L的无血清ECM培养液培养),⑤PKC抑制剂组(GF109203x浓度10μmol/L+葡萄糖浓度25mmol/L+Hcy浓度lmmol/L的无血清ECM培养液培养),干预24小时后,收集细胞及细胞上清液。2、观察指标：①倒置相差显微镜下观察细胞形态；②MTT法检测细胞活性；③DHE荧光探针标记细胞内的ROS; ④ELISA法检测细胞上清液中硫化氢(H2S)的水平；⑤采用ELISA法检测各组细胞内8-OHdG、核因子-κB (NF-κB)、烟酰胺腺嘌磷酸氧化酶4(Nox4). HIF-1α蛋白的表达及PKC活性；⑥采用Real-Time PCR法检测各组细胞内HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达。3、统计学处理：实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,各组计量资料数据均采用均数±标准差(x±s)表示。两组间样本比较采用t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。三、大蒜素与Hcy在一定温度及PH条件下的反应1、Hcy与二烯丙基三硫醚在体外的反应称取1: mmol的Hcy溶于磷酸盐缓冲液(PBS) 20ml (PH=7.4)中,搅拌至完全溶解,二烯丙基三硫醚05mmol完全溶于二甲基亚砜(DMSO)中后,于Hcy溶液中逐滴加入二烯丙基三硫醚溶液,37℃油浴,并用搅拌器不断搅拌,充分混匀及反应,每30分钟～1小时,薄层层析(TLC)检测,254nm紫外灯检测,TLC板用碘熏显色,共反应6小时。后应用乙酸乙酯提取,TLC检测及碘熏显色。再用碳酸氢钠调PBS至PH=8,重复上述步骤。2、Hcy与大蒜素注射液(三硫二丙烯)在体外的反应称取1mmol的Hcy溶于磷酸盐缓冲液(PBS) 14ml (PH=7.4)中,搅拌至完全溶解,逐滴加入大蒜素注射液6ml,37℃油浴,并不断在搅拌器上搅拌,每30分钟～1小时,TLC检测,254nm紫外灯检测,TLC板用碘熏显色,共反应6小时。后应用乙酸乙酯提取,TLC检测及碘熏显色。再用碳酸氢钠调PBS至PH=8后,重复上述步骤。3、Hcy与二烯丙基二硫在体外的反应称取0.494mmol的Hcy于5ml的PBS (PH=7.4)中,完全溶解,然后滴加0.247mmol的二烯丙基二硫溶液3m1,37℃油浴,并不断在搅拌器上搅拌,每30分钟～1小时,TLC检测,254nm紫外灯检测,TLC板用碘熏显色,共反应6小时。后应用乙酸乙酯提取,TLC检测及碘熏显色；再用二氯甲烷提取,TLC检测及碘熏显色。四、大蒜素对高糖乏氧条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用机制1、细胞培养及处理：采用小鼠主动脉内皮细胞,37℃、5%CO2培养箱内ECM培养基培养及传代,第三代细胞用于实验,待细胞生长至对数生长期,将细胞分为5组：①正常组(葡萄糖浓度5.5mmol/L的无血清ECM培养液培养),②甘露醇组(甘露醇浓度25mmol/L的无血清ECM培养液培养),③高糖乏氧组(X/XO作用30分钟,后加用葡萄糖浓度25mmol /L的无血清ECM培养液培养),④大蒜素组(X/XO作用30分钟,后加入大蒜素浓度10μmol/L+葡萄糖浓度25mmol/L的无血清ECM培养液培养),⑤PKC抑制剂组(X/XO作用30分钟,后加入GF109203x浓度10μmol/L+葡萄糖浓度25mmol/L的无血清ECM培养液培养),干预24小时后,收集细胞及细胞上清液。2、观察指标：①倒置相差显微镜下观察细胞形态；②MTT法检测细胞活性；③DHE荧光探针标记细胞内的ROS；④采用ELISA法检测各组细胞内8-OHdG, NF-κB、Nox4、HIF-1α蛋白的表达及PKC活性；⑤采用Real-Time PCR法检测各组细胞内HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA和 NF-κB mRNA的表达。3、统计学处理：实验数据采用SPSS 130软件进行统计学分析,各组计量资料数据采用均数±标准差(x±s)表示。两组间样本比较采用t检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果一、大蒜素对糖尿病高同型半胱氨酸血症患者治疗的临床观察1、糖化血红蛋白的变化：治疗3个月后,两组患者糖化血红蛋白水平较治疗前均明显下降(P<0.01),两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),但大蒜素治疗组患者糖化血红蛋白下降有更明显的趋势。2、Hcy的变化：治疗3个月后,大蒜素治疗组Hcy明显降低,较治疗前有统计学意义(P<0.01),而对照组Hcy水平较治疗前的变化无统计学意义(P>0.05)。3、颈动脉IMT的变化：大蒜素治疗组治疗后颈动脉IMT明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组治疗后IMT也有降低(P<0.05),但大蒜素治疗组较对照组下降更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。4、不良反应：本研究中因各种原因导致对照组失访1例,另有大蒜素治疗组1例因肝酶升高超过2倍以上而停药,停药后肝酶恢复正常,因此共38例患者符合研究要求。二、大蒜素对高糖高Hcy条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用机制1.主动脉内皮细胞形态学的观察：高糖高Hcy组小鼠主动脉内皮细胞形态损伤明显,表现为细胞皱缩,细胞间的联系减弱,部分细胞即将从培养板底部脱离,少量细胞漂浮于培养液中,而大蒜素组内皮细胞形态损伤较轻,生长状态明显好于高糖高Hcy组。2.主动脉内皮细胞活性的改变：与正常对照组相比,高糖高Hcy组细胞存活率明显下降(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞存活率较高糖高Hcy组明显上升(P<0.05)。3.主动脉内皮细胞ROS的产生：高糖高Hcy组细胞内ROS生成量较正常对照组明显增多(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞内ROS含量较高糖高Hcy组明显下降(P<0.05)。4.细胞上清液中H2S的变化：大蒜素组H2S含量较其他各组均明显上升(P均<0.05)。5.主动脉内皮细胞中8-OHdG、NF-κB、Nox4、HIF-1α蛋白的表达及PKC活性的改变：高糖高Hcy组细胞内8-OHdG、NF-κB、Nox4、HIF-1α、PKC含量较正常对照组明显增多(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞内8-OHdG、NF-κB、Nox4、HIF-1α、PKC含量较高糖高Hcy组明显下降(P<0.05)。6.主动脉内皮细胞中HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达的变化：高糖高Hcy组HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达较正常对照组均明显升高(P均<0.01)；与高糖高Hcy组相比,大蒜素组及PKC抑制剂组HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达均明显下降,具有统计学意义(P均<0.05)。三、大蒜素与Hcy在一定温度及PH条件下的反应1、Hcy与二烯丙基三硫醚在体外未发生反应。2、Hcy与大蒜素注射液(三硫二丙烯)在体外未发生反应。3、Hcy与二烯丙基二硫在体外未发生反应。四、大蒜素对高糖乏氧条件下体外培养的小鼠主动脉内皮细胞的保护作用机制1、主动脉内皮细胞形态学的观察：高糖乏氧组小鼠主动脉内皮细胞形态损伤明显,而大蒜素组在高糖乏氧的基础上加入10μg/ml的大蒜素,培养24小时后,内皮细胞形态损伤减轻,生长状态明显好于高糖乏氧组。2、主动脉内皮细胞活性的改变：与正常对照组相比,高糖乏氧组细胞存活率明显下降(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞存活率较高糖乏氧组明显上升(P<0.05)。3、主动脉内皮细胞ROS的产生：应用DHE荧光探针法检测细胞内ROS结果显示,与正常对照组相比,高糖乏氧组细胞内ROS生成量明显增多(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞内ROS含量较高糖乏氧组明显下降(P<0.05)。4、主动脉内皮细胞中8-OHdG、NF-κB、Nox4、HIF-1α蛋白的表达及PKC活性的改变：与正常对照组相比,高糖乏氧组细胞内8-OHdG、NF-κB、Nox4、 HIF-1α、PKC含量明显增多(P<0.01),而大蒜素组和PKC抑制剂组细胞内8-OHdG、NF-κB、Nox4、HIF-1α、PKC含量较高糖乏氧组明显下降(P<0.05)。5、主动脉内皮细胞中HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达的变化：与正常对照组相比,高糖乏氧组HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κBmRNA的表达均明显升高(P均<0.01)；与高糖乏氧组相比,大蒜素组及PKC抑制剂组HIF-1α mRNA、Nox4 mRNA 和 NF-κB mRNA的表达均明显下降,具有统计学意义(P均<0.05)。结论1、大蒜素能显著降低糖尿病高同型半胱氨酸血症患者血Hcy的水平,调节血糖,同时显著改善患者颈动脉内膜中层厚度,对糖尿病大血管病变有较好的防治作用。2、大蒜素对高糖高Hcy环境下主动脉内皮细胞有明显的保护作用,其作用机制可能与增加H2S的生成,抑制PKC激活,下调8-OHdG、HIF-1α、Nox4和NF-κB的表达,降低ROS的生成,减轻氧化应激损伤有关。3、三硫及二硫大蒜素与Hcy在体外PH7.4,37℃,0-6小时内不发生反应。4、大蒜素对高糖乏氧环境下主动脉内皮细胞有明显的保护作用,其作用机制可能与抑制PKC通路的激活,下调8-OHdG、HIF-1α、Nox4和NF-κB的表达,降低ROS的生成,减轻氧化应激损伤有关。