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背景与目的遗传性异常纤维蛋白原血症(Congenital Dysfibrinogenemia,CD)是一种罕见的遗传性疾病,常因纤维蛋白原(Fg)三个同源编码基因缺陷,从而引起纤维蛋白原结构与功能异常。该病临床表现高度异质性:出血、血栓或者无任何症状。国外一项跟踪随访研究报道,在疾病的发展过程中,无症状CD患者在基因与环境相互作用下,临床表现会有所改变,可能有出血表现或者血栓形成。CD的诊断主要依靠临床实验室检查。其诊断标准为:TT明显延长,纤维蛋白原活性水平与纤维蛋白原抗原浓度之间存在显著性差异。应用Clauss法检测Fg活性水平,PT换算法或免疫比浊法检测Fg抗原浓度。明确CD的基因突变位点对CD诊断、治疗与优生优育产前基因诊断尤为重要,还可帮助进一步深入探究CD的分子致病机制,并且对患者出血、血栓等的风险评估很有价值。方法(1)收集4个CD先证者及家系成员的病史资料、做好家系调查;(2)提取血细胞DNA,设计并合成特异性引物,用PCR扩增FGA、FGB、FGG基因所有外显子及侧翼序列,获得目的产物,进行直接测序分析,查找患者基因突变类型;(3)提取并纯化患者血浆Fg,进行Maldi Tof质谱检测,分析变异肽段;(4)应用Western blot检测分析患者Fg肽链的相对表达量,以明确Fg缺陷类型;(5)根据相应的突变位点,进行纤维蛋白肽释放试验、纤维蛋白聚集试验及纤维蛋白溶解试验分析;(6)扫描电子显微镜观察纤维蛋白网状结构。通过以上方法,初步探讨CD患者分子致病机制。结果(1)4个先证者的凝血检测结果特征为:Fg抗原浓度(PT换算法)正常,而Fg活性水平(Clauss法)低,TT显著延长。⑵基因测序发现先证者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为纤维蛋白原FGA第2外显子g.1232G>A杂合突变,即AαArgl6His错义突变。先证者Ⅳ为FGA第2号外显子发生g.1233 C>T杂合突变,即AαArg16Cys错义突变。⑶质谱检测发现4例先证者均存在变异肽段;Western blot检测分析患者Fg肽链相对表达量无异常变化。⑷4例先证者的纤维蛋白肽A释放率与释放总量均明显降低,聚集曲线中均可见明显延长聚集期,最大OD值低于健康对照;溶解曲线中出现明显停滞期,50%溶解时间延迟。⑸扫描电子显微镜观察到4例先证者的纤维更纤细,粗细不均,先证者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ形成的纤维蛋白网状结构疏松,网状孔径较大,但先证者Ⅳ形成的纤维蛋白网状结构较正常结构紧密。结论1.本研究报道的Aα16Arg→His与Aα16Arg→Cys为热点突变,结果与文献报道一致。2.成功运用Western Blot研究CD患者Fg缺陷类型,结合SDS-PAGE蛋白电泳技术,分析Fg肽链的相对表达量无异常变化。3.Aα链第16位Arg突变为His或者Cys均能引起凝血酶与纤维蛋白原结合异常,导致纤维蛋白肽释放减少,进一步引起聚集反应与纤溶反应异常。此为本研究4个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的分子致病机制。