论文部分内容阅读
ROPs (Rho of plant, ROPs)是植物体内特有的RhoGTPases(小G蛋白),这类蛋白是真核生物体内非常保守的分子开关,在细胞中具有ROPGDP(非活性)和ROPGTP(活性)两种形式。ROPs在植物发育过程中扮演了重要的角色,例如,在植物应对外界环境刺激时,ROPs及其相关调控因子都会随之发生相应的应急反应。RopGEFs是ROPs的正调蛋白,通过促进GDP从ROP蛋白中的解离,加速ROPGTP的激活。在拟南芥基因组中,已被表明的RopGEFs一共有15个,其中14个属于一类含有PRONE结构域的RopGEF家族(从RopGEF1到RopGEF14),而另外一个是含有Dock 180结构域的RopGEF(即SPIKE1)。尽管有研究表明RopGEFs在植物发育中发挥了重要的调节作用,但是RopGEFs在ABA信号传导过程中发挥了怎样的作用,特别是在种子萌发和气孔的运动过程中,相关机制极其匮乏。本论文以拟南芥中的两个RopGEFs (AtRopGEF2和AtSPIKE1)为研究对象,通过对它们的功能缺失和表达量降低的Artifical MicroRNA功能缺陷型突变体的研究,发现AtRopGEF2 (RopGEF2)和AtSPIKE1 (SPIKE1)分别参与了ABA调控的种子萌发和气孔关闭过程,揭示了RopGEFs在ABA信号传导中的调控机制。我们的结果表明,RopGEF2是ABA抑制的种子萌发过程中的负调控因子之一。当ABA存在时,功能缺失突变体,opgef2-ko的种子萌发呈现出对ABA的超敏感表型。进一步的研究表明,ABA可以通过26S泛素-蛋白酶体系统降解RopGEF2,由此减弱下游ROPs信号。我们的结果还表明,RopGEF2的蛋白稳定性与其亚细胞定位以及与ROPs的结合状态密切相关。具体表现为：当RopGEF2与ROPs相结合不仅可以改变RopGEF2的亚细胞定位,同时减弱了ABA诱导的RopGEF2的降解。RopGEF2有明显的线粒体上定位,是该GEF蛋白的独特之处。迄今,还未见有任何一例GEF蛋白定位于线粒体的报道。此外,我们研究了拟南芥中唯一的含有Dock180结构域的RopGEF,即SPIKE1(SPK1),并探讨了它在ABA诱导的气孔运动过程中的功能。结果显示,SPKl参与了ABA诱导的保卫细胞微丝细胞骨架的重排过程。我们发现,SPK1的功能受到了钙离子依赖蛋白激酶CPK3介导的磷酸化的调控。通过体外重构ABA-PYR1-ABI1这一信号级联通路,我们认为ABA通过受体PYR1解除ABI1(PP2C类磷酸酶)对激酶CPK3的抑制作用,从而启动CPK3的功能,促使CPK3对SPK1磷酸化,降低了SPK1与ROP6的结合能力,这样ROPs信号通路的水平受到了阻碍。结果,ROPs信号通路水平的变化最终导致了保卫细胞中微丝细胞骨架的重排,影响了气孔运动对ABA的响应。本论文的主要研究结果包括以下几个方面：1.缺失突变体ropgef2-ko增强了种子萌发对ABA的响应；而互补转基因植株RopGEF2/ropgef2-ko(Com-8和Com-10)的种子萌发表型则与野生型的相似,说明ropgef2-ko种子萌发的超敏感表型与RopGEF2基因的缺失密切相关。因此,该结果说明了RopGEF2参与了ABA抑制的种子萌发过程,并在其中发挥了重要的负调作用。2.荧光定量RT-PCR结果表明RopGEF2在大部分组织中都有表达。通过对RopGEF2pro-GUS的组织表达谱进行分析,发现RopGEF2在发育的胚胎以及萌发的种子中均呈现明显的表达模式,再次反映了RopGEF2在种子萌发过程中不可或缺的作用。3. YFP-RopGEF2的亚细胞定位结果显示出YFP-RopGEF2主要分布在细胞周边(近细胞膜处),细胞质和线粒体中,而PRONE2结构域对于RopGEF2的线粒体定位是必需的,这些结果暗示了在植物体内RopGEF2可能存在独特的调控机制。4.通过酵母双杂、双分子荧光互补以及Pull-down实验表明RopGEF2可以和参与ABA信号传导的3个ROPs (ROP2,ROP6和ROP10)相互作用。进一步的实验结果表明RopGEF2和ROPs的这种相互作用可以改变RopGEF2在细胞中的位置以及蛋白稳定性,说明ROPs参与了RopGEF2的调控过程。5.ABA对RopGEF2的转录水平没有影响,但是它可以通过26S泛素-蛋白酶体系降解胞内的RopGEF2蛋白；这一降解过程主要发生在细胞浆中,暗示RopGEF2的细胞定位与它的蛋白稳定性息息相关。6.通过对SPIKE1(SPK1)表达量下降的转基因amiR-SI K1植株的分析,我们发现,amiR-SPK1转基因株系对ABA呈现超敏感的表型。通过分析amiR-SPK1转基因株系的失水率,证实了SPK1参与ABA诱导的气孔关闭的过程。而且,与CA-rop6杂交抑制了amiR-SPKl转基因株系的气孔表型。这些结果说明SPK1可能是通过ROP6参与ABA调控的气孔关闭过程。7.通过比较分析叶片保卫细胞中微丝细胞骨架对ABA的响应,发现amiR-SPK1转基因株系中保卫细胞的微丝细胞骨架对ABA处理更加敏感。ABA处理后amiR-S K1保卫细胞中的辐射状微丝细胞骨架的比例明显低于野生型保卫细胞中的。8.半体内(semi-in vivo)Pull-down和磷酸化实验表明,钙离子依赖蛋白激酶CPK3可以和SPK1互作并磷酸化SPK1,SPK1的S408位点是CPK3磷酸化的主要靶位点。9.ABA可以降低SPK1和ROP6的结合能力,而用CPKs类激酶的抑制剂W-7处理则消除了ABA的这种抑制效应。这个结果说明ABA可以抑制SPK1和ROP6的结合,而且这种抑制作用是依赖于CPKs的激酶活性的。10.通过体外重构实验以及磷酸化实验,我们发现ABA可以通过信号通路中的关键成员,如受体PYR1、磷酸酶ABI1和钙离子依赖蛋白激酶CPK3来调节SPK1的磷酸化水平。我们的结果暗示了ABA受体PYR1可以抑制PP2C磷酸酶AB11的活性,从而释放并激活了蛋白激酶CPK3的活性,而活化的CPK3可以磷酸化SPK1,最终影响SPK1的功能,调控胞内ROPs信号的水平。