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目的通过对骨肉瘤分泌外泌体中的miRNA对于骨肉瘤自身瘤体及瘤体内成血管作用的学习,通过分析瘤体大小、体重、体积以及血管数量等指标,研究骨肉瘤细胞分泌的外泌体中的miR-181d对于肿瘤血管生成效应的作用及机制。方法从GEO数据库挖掘出的系列号为“GS65071E”的数据组,该数据组详细的列出了骨肉瘤患者取下的标本中的各种miRNA的种类、名称以及含量;通过“R”语言运算方法,结合“dplyr”及“limma”程序包运算,得出其中含量最高且与肿瘤成血管作用相关的10个miRNA;购买人骨肉瘤细胞系U2-OS,人血管内皮细胞系HUVEC,培养U2-OS骨肉瘤细胞,随后通过差速离心法对人骨肉瘤细胞U2-OS分泌的外泌体进行收集,得到骨肉瘤外泌体（OS-Exos）,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对于上述10个miRNA在骨肉瘤细胞分泌外泌体中的含量进行排序,得出含量最高即为miRNA-181d。通过蛋白质免疫印迹技术（Western Blot,WB）对外泌体表面特征性蛋白进行检测,同时通过纳米粒子跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）及高解析穿透式电子显微镜（TEM,Transmission Electron Microscope）用以验证提取出的细胞外颗粒为外泌体。通过病毒转染实验以获得miRNA-181d的模拟物以及抑制剂。血管内皮细胞吞噬外泌体免疫荧光实验以验证外泌体进入血管内皮细胞发挥作用。Transwell实验用以检测骨肉瘤细胞接受不同处理后（空白组、外泌体组、miRNA-181d模拟物组,miRNA-181d抑制剂组）,骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力。基质胶成血管实验通过血管连接处个数以及整体血管长度反映不同处理后血管内皮细胞形成血管的能力。鸡胚成血管实验用以检测血管内皮细胞接受不同处理后（空白组、外泌体组、miRNA-181d模拟物组,miRNA-181d抑制剂组）,形成血管连接数以及血管长度,以此反应内皮细胞成血管程度。蛋白质免疫印迹技术（Western Blot,WB）反映体外实验成血管相关蛋白以及相关信号通路蛋白表达情况。体内实验包含裸鼠后肢成瘤实验,不同处理（空白组、外泌体组、miRNA-181d模拟物组,miRNA-181d抑制剂组）的4组裸鼠,通过测量裸鼠体重以及后肢瘤体大小得出瘤体增大趋势,同时通过蛋白质免疫印迹技术反映瘤体内相关血管蛋白以及信号通路相关蛋白的表达含量;免疫荧光染色技术通过对血管相关蛋白的染色,直观的反映瘤体内成血管相关蛋白的含量。同时对瘤体切片进行免疫组化染色,通过增殖指标及凋亡指标提示各组中肿瘤生长及活跃程度。结果1.生信分析结果提示人骨肉瘤标本中与血管相关miRNA包含miR-181d等;2.qRT-PCR结果提示在所提取的U2-EXOs中,miR-181d为筛选出的10种miRNAs中含量最高的。3.纳米粒子跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）结果表明所提取的细胞外物质为直径范围介于30-120nm之间;高解析穿透式电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）结果提示所提取的细胞外物质为双层结构装的圆形囊泡;蛋白质免疫印迹技术（Western Blot,WB）结果显示所提取的细胞外物质表面存在外泌体特异性蛋白CD63,CD9以及Flotillin-1,而对照组肿瘤细胞表面几乎不含此3种蛋白,上述结果表明所提取的物质为外泌体。4.Transwell实验结果表明,经过miR-181d模拟物处理组,骨肉瘤细胞的侵袭迁移能力显著高于其余3组,证明miR-181d具有促进骨肉瘤细胞迁移侵袭的能力。5.基质胶成血管实验、鸡胚成血管实验结果提示,经过不同处理后,miRNA-181d模拟物处理组的血管连接处个数及总血管长度显著高于其他三组,提示miR-181d显著增强血管内皮细胞成血管能力。6.体内及体外WB实验结果提示,经过上述4种处理后,miRNA-181d模拟物处理组血管相关蛋白CD31及α-SMA,以及相关通路蛋白PI3K/AKT,MEK/ERK蛋白含量均上调且高于其他三组,表明miR-181d通过PI3K/AKT,MEK/ERK两条信号通路发挥促进血管生成的作用。7.免疫荧光染色实验结果表明所提取的外泌体可以被血管内皮细胞吸收从而发挥作用;以及裸鼠瘤体经过miR-181d模拟物处理后,其内血管相关蛋白CD31表达明显高于其他三组。8.裸鼠成瘤实验结果提示,经过miR-181d模拟物处理的裸鼠组,其体重及后肢肿瘤体积、重量均远超其余三组。结论1.在miRNA-181d模拟组中的各个实验均观察到了强烈的血管生成。2.miRNA-181d调控PI3K/AKT和Mek/Erk信号通路从而促进骨肉瘤血管以及肿瘤生长。