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肝细胞癌（简写HCC）的发生和发展是多基因参与、多阶段进行的复杂过程,基因表达分析能对肝癌的诊断与预后提供帮助。然而在单项测定这些肿瘤标志物时其灵敏性、特异性、或临床实用性等方面或多或少都存在一定的局限性。随着肿瘤基因组学研究的不断深入,越来越多的肝癌相关基因被报道,因此,综合分析肝癌发生过程中多基因的表达变化,有助于优化更多的分子指标来联合诊断HCC。研究目的:从本实验室建立的HCC高/低表达基因cDNA文库和国内外文献中筛选肝癌高表达基因10个（ANGPT2、BIRC5、CLDN10、E2F1、GPC3、HGF、MMP2、PIN1、SPINT2、TFDP1）和低表达基因6个（APC、DLC1、MGMT、P16、PRDM2、PTEN）,合计16个基因。利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在正常肝、肝炎、肝硬化、肝癌组织和癌旁组织间的差异表达情况,及与临床病理学特征的关系,最终筛选在HCC中表达水平较正常肝细胞差异大、特异性好的基因建立分子诊断指数（Molecular Diagnostic Index,MDI）,初步评估其在HCC诊断中的价值。研究方法:选择81例手术切除组织标本,其中5例正常肝、4例慢性肝炎、12例肝硬化、60例HCC和癌旁组织,提取总RNA后逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR对16个进行基因的表达分析,以管家基因G3PDH为作为参比基因,2-△△CT法计算目的基因相对表达量,依据表达异常的基因个数建立分子诊断指数;用ROC曲线评价分子诊断指数对肝癌的诊断价值;免疫组化法分析GPC3在组织中蛋白表达水平,ELISA检测HGF在血清中的含量,进一步与实时荧光定量PCR结果进行比对分析。研究结果:依据各基因的荧光定量相对值做散点图,GPC3、E2F1、BIRC5等癌基因从肝炎、肝硬化到癌组织呈现明显的递增趋势,而MGMT、DLC1和PRDM2等抑癌基因呈现明显的递减趋势;同时簇状柱状图表明上述癌基因在部分患者中从癌旁组织2cm（N2）、0cm（N0）到癌组织的表达呈现明显的递增趋势,而抑癌基因呈现明显的递减趋势。通过对每个基因在正常肝、肝炎、肝硬化、肝癌组的相对定量值进行统计学分析,表明BIRC5（正常组1.15±0.45,肝炎组1.52±0.38,肝硬化组2.08±0.87,肝癌组10.72±0.68）、CLDN10（正常组1.07±0.41,肝炎组1.81±0.63,肝硬化组2.48±0.43,肝癌组0.86±1.21）、GPC3（正常组1.12±0.45,肝炎组1.33±0.84,肝硬化组9.76±2.33,肝癌组147.52±1.53）、TFDP1（正常组1.06±0.23,肝炎组0.92±0.38,肝硬化组1.41±1.23,肝癌组0.50±1.32）、DLC1（正常组1.15±0.66,肝炎组1.38±0.67,肝硬化组2.09±0.21,肝癌组0.66±0.56）、HGF（正常组1.04±0.32,肝炎组2.38±1.22,肝硬化组3.81±2.56,肝癌组0.94±0.54）、MGMT（正常组1.14±0.52,肝炎组0.94±0.34,肝硬化组1.16±2.12,肝癌组0.39±1.12）、PRDM2（正常组1.13±0.61,肝炎组1.06±0.23,肝硬化组1.53±1.67,肝癌组0.55±0.65）等8个基因在两组或多组间存在差异（P<0.05）,具有统计学意义。在此基础上选择GPC3、E2F1、BIRC5、MGMT、DLC1和PRDM2等6个基因建立肝癌分子诊断指数MDI,结果显示其在正常组和肝炎组为0,在肝硬化组为0.83±0.83,在N2值为1.35±0.99,N0组为1.55±1.14,HCC为4.42±1.20,差异显著;每个标本的MDI从癌旁到癌组织呈上升趋势;ROC曲线分析显示MDI≥3时诊断肝癌,其敏感性为96.65%,特异性92.85%,AUC为99.4%;将MDI为5、6的标本定义为高MDI组,MDI为3、4的标本定义为低MDI组,结果显示后者生存曲线略高,低MDI组预后较好;MDI≥3的例数（58/60）与临床资料中AFP值（21/60）对比分析表明MDI对肝癌诊断敏感性高于AFP。进一步,免疫组化检测GPC3显示60例癌标本中45例高表达,ELISA检测血清中GPC3表达显示肝癌组为（1.40±0.33）ng/ml高于正常对照组（0.40±0.04）ng/ml;HGF免疫组化结果显示癌旁组织染色强于肝癌组织,同时血清表达水平肝癌组（1.34±0.16）ng/ml高于正常组（0.25+0.04）ng/ml。研究结论:通过实时荧光定量RT-PCR分析16个基因在正常肝、肝炎、肝硬化、肝癌组织中相对表达,表明GPC3等8个基因的表达在各组中存在明显差别。选取的GPC3等6个基因对各标本进行MDI检测结果显示其具有高特异性和高敏感性,通过筛选更多基因并优化组合,MDI有望成为鉴别诊断早期肝癌或预警的一种有效方法。GPC3在组织中mRNA、蛋白表达和血清中蛋白表达水平具有一致性;从RT-PCR和免疫组化结果显示,肝癌患者血清中HGF升高可能主要是由癌旁组织分泌的。