当今时代,纳米技术日新月异,各种纳米产品层出不穷。在众多的纳米材料中,纳米银因其优良的抗菌特性位居纳米材料应用的榜首。在医疗卫生、食品加工、工业生产等方面的广泛应用使纳米银在人类社会的发展中发挥着重要的促进作用,但同时也在无形之中增加了纳米银与人体接触的机会,带来了潜在的安全隐患。研究表明,纳米银可通过呼吸系统、消化系统和皮肤接触进入机体,也可沿嗅觉神经和三叉神经到达中枢神经系统。进入机体的纳米银通过血液循环分布到全身的组织、器官,并能穿越血脑屏障到达脑组织,在脑中蓄积,引发中枢神经毒性。目前,关于纳米银的神经毒性效应主要包括受试动物的脑部组织病理学效应、行为学改变、神经递质水平改变等,其毒作用机制与炎性反应、氧化应激相关。对于纳米银的神经毒性及毒作用机制研究还不是很充分,需要不断探索,进而为纳米银的应用及其生物安全性评价提供实验支持和理论依据。基于此,本研究选用秀丽隐杆线虫和小鼠海马神经细胞(HT22细胞)两种实验模型为研究对象,通过纳米银对秀丽隐杆线虫的延长暴露探讨纳米银对其行为、学习、记忆的影响,从体内实验角度研究纳米银的神经损伤效应,通过对HT22细胞进行24 h的直接暴露研究纳米银对HT22细胞的细胞毒性作用,并进一步探讨氧化应激和自噬在细胞损伤中的作用,为纳米银的毒作用机制研究提供支持和依据。1.纳米银材料的表征:通过TEM检测发现,本研究所使用的纳米银呈球形,粒径主要集中于13-21 nm,平均粒径为20.14 nm;通过马尔文粒度分析仪检测结果发现,纳米银的水合粒径主要集中分布于100-1000 nm之间,平均水合粒径为566.5 nm,Zeta电位值为0.323 mV。表明实验所用的纳米银材料在培养基中略有团聚现象,分散程度相对较好。2.纳米银对秀丽隐杆线虫的神经毒性研究:不同剂量纳米银染毒组的线虫头部摆动、身体弯曲频率均不同。与空白对照组相比,线虫的头部摆动频率随纳米银染毒浓度的升高逐渐下降,其中,除25μg/ml剂量组与空白对照组比较无明显差异外(P>0.05),50、100、200μl/ml染毒组头部摆动频率均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组相比,25、50、100、200μg/ml剂量组秀丽隐杆线虫的头部摆动频率分别下降了5.56%、16%、25.47%、25.57%。线虫的身体弯曲频率随纳米银染毒剂量的升高逐渐下降,与空白对照组相比,25、50、100、200μg/ml剂量组头部摆动频率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组相比,25、50、100、200μg/ml剂量组线虫身体弯曲频率分别下降了21%、37.50%、45.60%、53%。表明20 nm纳米银能够影响秀丽隐杆线虫的头部摆动和身体弯曲行为,且相同染毒剂量下纳米银对线虫身体弯曲频率的影响均大于对头部摆动频率的影响。在纳米银对秀丽隐杆线虫学习能力影响的实验中发现,未经纳米银暴露的线虫或染毒剂量较小的线虫,能够更好的将饥饿引发的信号和NaCl的浓度信号整合起来,当纳米银染毒浓度较高时,线虫向NaCl区移动数目随着染毒剂量的增高不断增加,说明能够将饥饿和NaCl的浓度进行整合的线虫越来越少,线虫的联想性学习能力不断下降,表明随着染毒剂量的不断增加,纳米银对秀丽隐杆线虫的神经系统损伤越来越严重。在纳米银对秀丽隐杆线虫记忆能力影响的实验中发现,无论是空白对照组还是各剂量染毒组,随着饥饿时间的延长,在20℃温度范围内,秀丽隐杆线虫做IT运动的数量均呈不同程度的下降;随着纳米银染毒剂量的升高,在20℃范围内做IT运动线虫数目逐渐下降,空白对照组在各个测试时间点的线虫数量均最多,其次是25μg/ml染毒组,进而分别是50、100μg/ml染毒组,200μg/ml染毒组最少。在0、1、3h测试时间点上,染毒组与空白对照组的差异更明显(P<0.05),在7 h、12 h测试时间点上,染毒组与空白对照组的差异较小,说明在检测的前3 h,不同剂量纳米银染毒对线虫的记忆能力影响较大。该研究表明线虫的记忆能力与时间有关,时间越长记忆能力越差;并且随着纳米银染毒剂量的增加,越来越少的线虫能够凭借记忆将20℃温度条件和食物信号联系到一起,即纳米银对线虫的神经毒性随着染毒剂量的增加而逐渐增大。3.纳米银对HT22细胞毒性作用研究:MTT实验结果发现,HT22细胞经不同剂量纳米银染毒24h后,细胞存活率呈剂量依赖性下降,与空白对照组相比所有染毒组的细胞存活率差异都有统计学差异(P<0.05)。在25、50、100μg/ml剂量组中,细胞表现出较高的存活率,存活率分别为94.25%、87.07%、73.06%,说明在低于100μg/ml的染毒剂量下,纳米银对HT22细胞的生存率影响较小,当染毒浓度达到200μg/ml时,HT22细胞的存活率低至39.90%,400、800μg/ml剂量下HT22细胞的存活率分别为38.06%、27.37%。LDH实验结果发现,当染毒浓度低于400μg/ml时,HT22细胞LDH释放率呈剂量依赖性升高,与空白对照组相比所有染毒组LDH释放率均有统计学差异(P<0.05),而当染毒浓度达到800μg/ml时,LDH的释放率相比于400μg/ml剂量组有所下降。该实验结果说明纳米银能够影响HT22细胞LDH释放率,具有细胞毒性。细胞形态学研究发现,与正常培养条件下的HT22细胞相比,经不同浓度纳米银暴露染毒之后,细胞的形态发生了一定程度的变化。25、50μg/ml剂量组细胞形态变化不明显,漂浮细胞少,而100、200μg/ml剂量染毒组,可以很明显看到漂浮细胞增多,细胞间隙增大,细胞间通过突触的连接减少,细胞变圆,细胞膜边界不清等细胞受损现象。说明不同剂量纳米银会对细胞形态造成不同程度的损伤,低剂量(25、50μg/ml)对细胞形态的影响较小,高剂量(100、200μg/ml)染毒对细胞形态损伤较为严重。4.纳米银对HT22细胞毒作用机制研究:在纳米银对细胞ROS水平影响的实验中,我们发现纳米银对HT22细胞染毒后,各剂量组细胞内ROS水平变化有所差异,在较低剂量组中(25、50μg/ml),随着纳米银染毒剂量的增加,ROS水平升高,在较高剂量组中(100μg/ml)细胞内ROS水平下降,该结果说明,低剂量暴露纳米银能够促进HT22细胞活性氧生成增加,氧化应激增强,而当染毒剂量过大时,达到100μg/ml时,细胞产生ROS能力减弱;当加入氧化应激抑制剂NAC之后,HT22细胞中ROS水平没有随着纳米银染毒剂量的增加发生明显的变化。在纳米银对细胞自噬水平影响的实验中,我们发现无论是空白对照组还是实验组,均从细胞内观察到自噬小体的存在,证明细胞在正常培养条件下有自噬的发生,在被纳米银染毒后也有自噬的发生。两种自噬相关基因LC3和Beclin-1的表达水平结果显示,与空白对照组相比,LC3的表达水平在25、50μg/ml剂量下没有发生明显的改变,而在100μg/ml的高剂量染毒组中表达量显著增高(P<0.05);Beclin-1在25、50μg/ml剂量组中表达水平升高明显(P<0.05),在100μg/ml的高剂量染毒组中,基因表达水平与空白对照组相比没有发生显著变化。自噬相关蛋白的表达检测结果显示,纳米银染毒HT22细胞后,LC3-I蛋白表达水平不断降低,LC3-II蛋白表达不断升高,LC3-II/LC3-I数值在25μg/ml剂量下没有发生明显变化,在50、100μg/ml剂量下显著增高(P<0.05),Beclin-1蛋白的表达水平在100μg/ml剂量下显著增高(P<0.05),在25、50μg/ml剂量组中变化不明显。该实验结果表明低浓度纳米银染毒对HT22细胞自噬水平影响不大,而高浓度纳米银染毒可使HT22细胞自噬水平升高。在对细胞进行NAC预处理后,LC3-II/LC3-I数值在各剂量染毒组中均没有明显变化,Beclin-1蛋白的表达水平在各剂量染毒组中均没有发生显著变化,表明当抑制细胞氧化应激水平后,纳米银染毒不会对HT22细胞自噬水平产生明显影响。综上所述,不同浓度的纳米银暴露能够影响秀丽隐杆线虫的运动行为、学习及记忆能力,对线虫的神经系统造成损伤,且纳米银浓度越大损伤越严重,说明纳米银具有一定的神经毒性。此外,研究还发现纳米银能够破坏HT22细胞的正常形态,抑制细胞增殖,使细胞活力下降,随着纳米银染毒浓度升高损伤程度逐渐增强。在毒作用机制研究中发现,纳米银在中低剂量染毒时能够诱发ROS生成增加、氧化应激增强、启动细胞自噬,在高剂量染毒时ROS生成减少,细胞过度自噬,加速细胞死亡;通过氧化抑制剂预处理细胞后,纳米银对HT22细胞氧化应激和自噬水平的影响减弱,ROS水平和自噬水平在各剂量组中均没有显著差异,说明自噬水平受细胞内ROS水平的影响,ROS适度增强能够诱发自噬启动,但当ROS水平失衡时,自噬水平也随之失衡,此时纳米银对细胞的损伤也会凸现出来。本研究为纳米银的神经毒性及作用机制研究提供了理论支持和实验依据。