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烟草是重要的生物学模式植物，又是世界上重要的经济作物，因此烟草基因功能的研究对植物生物学和农业经济领域都有重要的意义。目前两个烟草二倍体种全基因组测序的完成，为烟草基因功能的研究提供了丰富的数据和研究平台。通过突变体研究基因功能是一种直接有效的策略，因此通过T-DNA激活标签法建立大规模突变体库，可实现对烟草基因功能的深入研究。本研究以T0代、T1代和T2代烟草突变体为研究材料，对T-DNA侧翼序列扩增方法进行了优化，对T-DNA侧翼序列进行了插入位点的分析和被插入基因的功能预测，对T2代突变体株系进行了表型突变性状调查并对单株侧翼序列进行了比对分析和基因型鉴定。通过试验，得到如下结果：（1）通过对TAIL-PCR、PCR walking、FPNI-PCR三种方法在T-DNA侧翼序列的扩增效率、序列长度和插入位点确定方面的比较，结果显示三种方法扩增侧翼序列的效率都在35%左右，由于PCR walking需要进行基因组的消化与连接，耗时大且操作繁琐。因此对TAIL-PCR和FPNI-PCR两种方法进行PCR程序、反应体系和引物设计等方面进行了优化，优化后TAIL-PCR可以获得大于1kb的条带，且扩增效率为55.4%，有33.42%的侧翼序列在NCBI nr数据库中比对到同源蛋白。FPNI-PCR在扩增条带长度小于1000bp，23.23%侧翼序列在NCBI数据库中的比对到同源蛋白，因此TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增。（2）通过生物信息学的方法，在烟草基因组数据库blastn中确定T-DNA在烟草基因组中的插入位置，91条侧翼序列中有34.07%插入到了基因上游，38.46%插入到了基因下游，27.47%插入到了基因区。T-DNA插入不是完全随机，而是偏好于插入到基因区。侧翼序列大于600bp时，在烟草基因组数据库中更容易确定基因的插入位点，而且随着基因长度的增大，越能准确的确定插入位点。当长度小于200bp时，很难确定插入位点。并且在NCBI nr数据库中比对插入位点附近基因同源蛋白时，搜索到相关基因功能类型有15种，基因表达产物有32种。（3）对田间种植的T2代突变体株系进行了突变表型性状调查，并对遗传T1代突变性状且表型变化较为一致的6个T2代株系MHT2-11、MHT2-35、MHT2-44、MHT2-66、MHT2-95、MHT2-125进行了株系间单株侧翼序列的比对，发现单株的侧翼序列相似性在94%~96%之间。通过对插入位点基因同源蛋白的比对，确定T-DNA在MHT2-35.13单株基因组的插入位点，并且搜索到插入位点附近的基因为bZIP转录因子，对该株系所有单株进行了基因型鉴定，T2代株系有基因型分离，确定T1代为单个等位基因的激活突变。