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种子老化是种质资源保存所面临的重要问题。探索种子老化的分子机理和优化种子贮藏方法是科学研究所面临的一大挑战。研究表明,重要气体信号分子一氧化氮(Nitricoxide,NO)在植物缓解胁迫和延缓衰老过程中起着重要作用,但是其是否参与种子老化的调控目前还尚未见报道。本研究以家榆(Ulmuspumila L.)种子为实验材料,对NO调控种子老化的机制进行研究。主要研究内容和结果如下:NO供体和抑制剂处理家榆种子结果表明,NO可以延缓老化过程中家榆种子活力的丧失。TTC染色结果显示,NO可以延缓家榆种子老化过程中的细胞死亡。DNA laddering和Caspase-3酶活检测结果表明,NO可以延缓家榆种子老化过程中的PCD过程。NO特异性荧光探针染色结果表明,NO在种子老化过程中呈现先升高后降低的趋势。硝酸还原酶(Nitrite reductase,NR)和类一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)相关试剂处理结果表明,NR和类NOS途径均参与了种子老化的调控。进一步用NO特异性荧光探针染色结果表明,NR和NOS可能通过调控NO的含量来延缓种子老化。将UpNOA1基因在拟南芥上进行过表达结果显示,UpNOA1的过表达可以延缓种子老化。这些结果综合表明,通过NR、NOS途径产生的NO可以延缓家榆种子老化过程中的细胞死亡。为了研究NO延缓家榆种子老化过程中细胞死亡的机制,用代谢组的方法检测了老化前后及NO处理前后种子的差异代谢物。对6种处理的代谢组进行比较发现,有550种受老化影响显著的潜在标志代谢物,其中244种代谢物老化后显著提高,306种代谢物显著降低。371种代谢物受NO影响显著,其中155种代谢物上调,216种代谢物下调。163种受老化调控的代谢物可以被NO所调控,表明NO可能参与种子老化的调控。KEGG功能分析发现谷胱甘肽代谢、糖代谢和甲硫氨酸代谢在种子老化过程中可以受到NO的影响。qRT-PCR检测结果显示,NO可以在转录水平激活谷胱甘肽代谢和甲硫氨酸代谢,但是对糖代谢途径相关基因的表达并没有显著影响。推测NO可能通过翻译后修饰调控糖代谢过程。为了研究NO介导的蛋白质S-亚硝基化修饰是否在种子老化过程中起作用,用Saville-Griess法和Biotin-Switch法分别检测了老化种子中SNO基团和S-亚硝基化蛋白的含量。结果显示二者变化与NO含量的变化趋势相一致,表明NO引起的S-亚硝基化修饰可能参与种子老化的调控。检测老化种子的S-亚硝基化蛋白质组,发现了82种S-亚硝基化蛋白,其中有11种为糖代谢相关蛋白。酶活性检测结果表明,S-亚硝基化可以激活糖酵解途径中的焦磷酸果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶和磷酸葡萄糖变位酶的活性,抑制磷酸戊糖途径中的6-葡萄糖酸脱氢酶的活性。同时本文还发现在动物细胞死亡过程中起重要作用的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)也发生了 S-亚硝基化。为了研究GAPDH是否参与家榆种子老化过程中细胞死亡的调控,克隆了UpGAPDH基因,用Overlap的方法将UpGAPDH的三个Cys进行点突变,原核表达并纯化了四种UpGAPDH蛋白。用Biotin-Switch法检测了四种蛋白的S-亚硝基化修饰程度,发现UpGAPDH有且仅有一个S-亚硝基化修饰位点——C154。酶活性检测记过表明,S-亚硝基化修饰可以抑制GAPDH的酶活性。将UpGAPDH基因在拟南芥上进行过表达结果显示,UpGAPDH的S-亚硝基化修饰可以加速种子老化。亚细胞定位结果显示,S-亚硝基化处理可以引起UpGAPDH发生聚集。有研究表明GAPDH的聚集可以参与细胞死亡调控,推测S-亚硝基化修饰引起的UpGAPDH蛋白的聚集,可能参与家榆种子老化过程中细胞死亡的调控。综上所述,本文建立了 NO通过转录调控和翻译后修饰延缓家榆种子老化过程中细胞死亡的模型。此研究将为进一步探索NO调控植物细胞死亡的分子机制奠定基础。