中国维生素C(Vc)生产目前主要采取3株菌参与的两步发酵工艺,即葡糖杆菌负责将D-山梨醇转化为L-山梨糖(醇糖转化),再由酮古龙酸菌和芽孢杆菌组成的混菌体系完成从L-山梨糖高效转化为2-酮基-L-古龙酸(糖酸转化)。经过多年的育种和工艺优化,Vc两步发酵无论在菌种和工艺方面都已达到相当高的水平,进一步提升的空间已很有限。将醇糖转化和糖酸转化的功能整合到同一株菌中实现从醇到酸的一步发酵是目前国内外Vc工艺改造的发展趋势,可望简化发酵工艺、缩短发酵周期、减少能源和基质消耗,大幅度降低Vc生产成本,提升Vc生产工艺水平。本实验室长期从事Vc两步发酵的分子生物学研究,完成了两步发酵重要菌株葡糖杆菌和酮古龙酸菌的基因组序列分析,阐明了产酸的关键基因,通过导入产酸基因在葡糖杆菌中实现了由醇到糖的一步转化。目前5L发酵罐培养产酸达20.4g/L,但转化率还不足10%。为了阐明山梨醇代谢途径和相关基因的功能,从而加强限速步骤,阻断代谢旁路,我们对山梨醇代谢的相关基因进行了研究。利用添加和不添加山梨醇的培养基培养葡糖杆菌H24,通过反转录和高通量测序比较了两种培养条件下菌体转录组的差异,结合文献报道初步确定与山梨醇产糖及产酸相关的酶包括3种山梨醇脱氢酶(SLDH)、山梨糖脱氢酶(SDH)、山梨酮脱氢酶(SNDH)和艾杜糖酸脱氢酶KGR,与旁路代谢相关的酶包括3种酮古龙酸还原酶(HADH)、3种山梨糖还原酶(SR)和木糖醇脱氢酶(XDH)。分别对以上基因进行了克隆、表达与活性分析,发现在3种酮古龙酸还原酶(HADH),其中HADH1活性最强,推测在H24中HADH1负责将酮古龙酸转化为L-艾杜糖酸,酮古龙酸还原酶的存在抑制了酮古龙酸(2-KGA)的积累,降低了2-KGA的产率,在Vc生产中2-KGA是Vc的前体,从而降低了Vc的产量。尝试采用同源重组方法对某些关键基因进行了敲除。为建立特异基因无痕敲除操作系统,探索了尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)在基因敲除技术中的应用,upp是一种反向筛选标记基因,在特定的条件下筛选,不含有标记基因upp的菌株却能够存活下来,从而可望实现在不引入抗性基因又达到了筛选的目的。构建了旁路基因的敲除载体,对山梨糖还原酶SR、酮古龙酸还原酶HADH和山梨醇脱氢酶SLDH进行了敲除,并成功获得了sr3的缺陷株,对山梨糖还原酶SR3进行了评价,发现山梨糖还原酶缺陷菌株在山梨醇、山梨糖、酵母粉碳源中生长的速度都远远高于野生菌株。对酮古龙酸菌SDH在异源宿主中进行了表达。通过对连接不同启动子的SDH在异源宿主中表达和活性分析,找到一个可以启动SDH在大肠杆菌中表达的启动子,且表达产物具有明显的生物活性。研究了酮古龙酸菌SDH的催化位点。通过生物信息学分析预测出2个催化位点,通过定点突变方法对各个位点进行了突变,并对突变体做了活性分析。结果表明2个位点的突变均可导致SDH活性丧失,说明这2个位点对山梨糖脱氢酶的催化功能非常重要。