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目的:观察富血小板血浆(PRP)与环磷酸腺苷(cAMP)共混物对兔肌腱干细胞增殖情况的影响和对兔跟腱病动物模型病变肌腱细胞组织结构、肌腱中I、III胶原纤维、I型金属蛋白酶及其拮抗剂表达情况的影响,初步分析PRP与cAMP共混物对兔肌腱干细胞以及受损肌腱的影响机制,探讨PRP与cAMP共混物对肌腱干细胞与病变肌腱可能的作用机理,为PRP与cAMP共混物对肌腱干细胞以及病变肌腱作用的进一步研究奠定基础。方法:(1)体外细胞实验。(1)细胞增殖情况观察:取一个直径为10cm培养皿(已铺满兔肌腱干细胞),对兔肌腱干细胞进行传代,取4份0.5ml细胞悬液分配到4个直径为3.5cm培养皿中,再加入3ml完全培养基。A皿为cAMP干预样本,B皿为PRP干预样本,C皿PRP与cAMP共混物干预样本,D皿为空白对照样本。1天后细胞贴壁,在A皿中加入1mlcAMP,在B皿中加入1mlPRP,C皿中加入0.5mlPRP与0.5mlcAMP的混合物,D皿不予干预,在B皿和C皿中加入200ul肝素钠抗凝。2天以后,观察A、B、C、D四皿中兔肌腱干细胞的增殖状况。(2)CCK8细胞增殖/凋亡实验:取一个24孔板,在细胞传代时,向其中16个孔各加入200ul细胞悬液,并做标记,随后每个孔中加入800ul完全培养基。1天后细胞贴壁,在A1-A4孔加入500ulcAMP悬液,B1-B4孔加入500ulPRP,C1-C4孔加入250ulPRP与250ulcAMP的共混物,D1-D4为空白对照组,不予处理。在B1-B4孔、D1-D4孔中加入100ul肝素钠以抗凝。放入CO2细胞培养箱,1天后吸取每个孔中的培养基并丢弃,用PBS轻轻洗掉第B1-B4,C1-C4中沉淀的红色血小板沉淀,清洗3-4次。A1-A4与D1-D4清洗一次即可,注意避免冲洗掉每个孔中的细胞。完成后,每个孔中加入1000ul完全培养基与100ulCCK8溶液,在细胞恒温箱避光放置3小时后,采用酶标仪在分光度为450nm波长下测定各孔中的OD值。(2)动物实验。把36只健康的雄性新西兰大白兔,体重2.25±0.19kg,适应性喂养一周后,随机分成6组,每组6只。A组为cAMP干预组,B组为PRP干预组,C组为PRP与cAMP共混物干预组,D组为单纯模型组,E组为生理盐水干预组,F组为正常对照组。按照化学造模法(跟腱注射前列腺素E2,浓度为500ng/0.2ml)对A、B、C、D、E组大白兔进行跟腱病造模。造模完成一周后对A、B、C、D、E按照不同方法进行干预。A组予以1mlcAMP在跟腱造模处腱围封闭干预,1次/3周,共2次,b组予以1mlprp在跟腱造模处腱围封闭干预,1次/3周,共2次。c组予以0.5mlprp与0.5mlcamp制成的共混物在跟腱造模处腱围封闭干预,1次/3周,共2次,d组不予任何干预。e组予以1ml生理盐水在跟腱造模处腱围封闭干预,1次/3周,共2次。f组作为正常对照组,同样不予处理。第二次干预完成4周后处死动物,取出造模处跟腱组织,制作细胞组织学切片及测定实验指标。(1)应用western-blot蛋白印迹法检测肌腱组织中mmp-1与timp-1的表达情况,比较各组间差异。(2)观察天狼星染色、h-e染色的跟腱组织切片、i/iii胶原pcr的表达,判定跟腱组织的修复情况,比较各组间的差异。结果:(1)体外细胞实验。(1)镜下观察c皿细胞增殖最为剧烈,d皿增殖最少,a、b两皿增殖状况处于c、d之间。(2)cck8实验显示c组细胞增殖最多与b、c、d组比较,差异具有统计学意义(p<0.05),a、b两组细胞增殖数量都有一定程度增长,两组组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。d组增殖最少,各组与d组相比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)动物实验。(1)i型金属蛋白酶(mmp-1)与其拮抗剂(timp-1)测定显示,c组mmp-1含量低,仅高于f组,d组与e组mmp-1含量最高,a、b两组介于d组与c组之间,组间对比:a组与b组比较差异无统计学意义(p>0.05),a组与c、d、e、f组比较,差异有统计学意义(p<0.05),b组与c、d、e、f组比较差异有统计学意义(p<0.05),c组d、e、f组比较(p<0.05)差异有统计学意义,d组与e组比较差异无统计学意义(p>0.05),d组与f相比差异有统计学意义(p<0.05),e组与f组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(2)timp-1含量测定显示:c组timp-1含量低,仅高于f组。d组与e组含量最高,a、b两组介于d组与c组之间。组间对比:a组与b组比较差异无统计学意义(p>0.05),a组与c、d、e、f组比较差异有统计学意义(p<0.05),b组与c、d、e、f组比较差异有统计学意义(p<0.05),c组d、e、f组比较(p<0.05)差异有统计学意义,d组与e组比较差异无统计学意义(p>0.05),d组与f组比较差异有统计学意义(p<0.05),e组与f组比较差异有统计学意义(p<0.05)。(3)i、iii型胶原pcr超微量核酸蛋白浓度显示:c组兔子超微量核酸蛋白浓度仅次于e组。a、b两组浓度介于c、d之间。组间对比:a组与b组比较差异无统计学意义(p>0.05),a组与c、d、e、f组比较差异有统计学意义(p<0.05),b组与c、d、e、f组比较差异有统计学意义(p<0.05),c组与d、e、f组比较(p<0.05)差异有统计学意义,d组与e组比较差异无统计学意义(p>0.05)。d组与f比较差异有统计学意义(p<0.05),e组与f组比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论:(1)肌腱干细胞通过适当方式诱导,能进行成脂与成软骨分化。(2)通过landesberg方法制备的prp性质与效果较为稳定,符合多数文献报道的效果。(3)cAMP通过减轻炎症反应,改善局部毛细血管通透性,促进肌腱干细胞增殖,降低受损肌腱MMP-1与TIMP-1的表达,增加受损肌腱组织中I、III型胶原的含量,使受损肌腱组织得到修复。PRP能促进肌腱干细胞增殖,减轻局部炎症反应,促进肌腱干细胞增殖,降低受损肌腱MMP-1与TIMP-1的表达,增加受损肌腱组织中I、III型胶原的含量,使受损肌腱组织得到恢复。(4)PRP与cAMP共混物能明显促进肌腱干细胞的增殖,促进受损肌腱组织修复,治疗作用优于单用PRP或cAMP.