【目的】1.回顾总结本中心应用异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗的难治复发急性髓细胞白血病(r AML)患者,研究影响预后的关键因素。2.应用高通量二代测序技术检测初诊及接受allo-HSCT后复发的r AML患者的肿瘤相关基因突变和克隆演变。3.研究Notch2基因在AML中的表达水平及可能的致白血病机制。【方法】1.回顾性收集101例于2003年10月至2012年12月期间,在苏州大学附属第一医院接受allo-HSCT的r AML患者,分析其年龄、FAB分型、分子/细胞遗传学、疾病状态、体能状态、化疗次数、移植类型等临床特征与移植后并发症及预后的影响。2.收集23例原发性r AML初诊标本和20例AML患者(12例AML及8例r AML)初诊及allo-HSCT后复发时的成对样本,应用DNA+RNA特异性基因Panel对390个肿瘤相关基因进行DNA测序(全部外显子及相关内含子)及全转录组测序(RNA-seq)。DNA平均测序深度为300×,RNA-seq测序深度为50M reads。分析r AML患者初诊时基因突变特征及移植后复发时的克隆演变。3.采用实时荧光定量PCR技术检测我中心52例初诊成人AML患者、10例急性淋巴细胞白血病(ALL)及10例健康对照的Notch2基因m RNA表达水平。比较Notch2基因m RNA表达水平在AML患者和ALL患者及正常对照之间以及AML各亚组之间的差异。分析Notch2 m RNA表达量与无病生存率(DFS)和总生存率(OS)之间的关系。同时制备Notch2过表达载体及靶向抑制Notch2的sh RNA质粒载体,分别转染髓系白血病细胞株THP-1,采用绝对计数等方法检测其对细胞生长的影响。【结果】1.101例接受allo-HSCT的r AML患者临床特征与预后的研究101例r AML患者中位年龄34岁(14-58),所有患者均接受清髓性移植。移植方式情况如下:1)38例HLA全相合同胞移植,2)33例HLA相合无关供体移植,3)30例HLA不全相合的亲缘移植。53例患者(52%)在移植前疾病缓解(CR组),而48例患者未缓解(NR组)。与CR组患者相比,NR组有更多患者存在FLT3-ITD突变(P=0.006),且体能状态更差(P=0.001),有更多患者行无关供体移植(P=0.027),更少例数接受再诱导化疗(P=0.002)。CR组患者5年OS为46%,而NR组为18%,两组5年累计复发率分别为45%和81%。然而,两组5年NRM是相似的(分别为28%和30%)。CR患者中,32例移植前MRD检测阳性(MRDpos),21例MRD阴性(MRDneg)。两组患者年龄、性别、FAB分型、危险分层及体能状态分布相似。MRDneg患者和MRDpos患者的5年预期OS分别为51%和41%(P=0.37),5年预期DFS分别为55%和36%(P=0.20),5年预期RI分别为21%和29%(P=0.43)。所有患者单因素分析发现,非M5/M6型AML,低危组细胞遗传学和分子遗传学、移植时CR状态以及移植前较好的体能状态与生存率正相关。多因素分析发现,与较好预后相关的因素是移植前CR状态(风险比[HR]=0.31,95%CI 0.12-0.81,P=0.017)和较好的体能状态评分(Zubrod-ECOG-WHO<3)。CR组患者单因素分析提示,非M5/M6型AML、低危组细胞遗传学和分子遗传学、FLT3-ITD突变阴性、良好的体能状态和化疗疗程数量≤4次与患者的生存率正相关。多因素分析发现三个独立的预后因素与较长的生存时间相关,分别是较好的体能状态(Zubrod-ECOG-WHO<3)(HR=0.13,95%CI 0.045-0.391,P<0.001)、细胞遗传学低/中危组(HR=0.30,95%CI0.103-0.853,P=0.026)和无FLT3/ITD突变(HR=0.22,95%CI 0.058-0.831,P=0.024)。2.allo-HSCT治疗r AML后复发克隆演变的初步研究(1)r AML患者初诊时基因突变特征23名r AML患者初诊时每个样本检出基因异常的中位数为4个(2-15)。出现频率最高的基因异常为FLT3突变。其次为TET2突变和MLL融合基因。生存分析发现,携带FLT3突变及MLL融合基因患者似乎预后更差,应用FLT3抑制剂能提高FLT3-ITD患者诱导缓解率,改善预后(2年OS 33%vs.75%)。(2)AML患者初诊及移植后复发时的基因改变20位AML患者初诊时最常见的四种基因突变为FLT3、DNMT3A、CEBPA和NPM1。涉及信号通路和表观遗传调控的基因突变最为多见。8名难治复发患者最常见的基因突变为FLT3和TET2。移植后首次复发时,出现突变频率较高的基因为MSH3、KMT2C、TSC2、WT1和NOTCH2。涉及表观遗传学及抑癌基因的基因突变最为多见。难治复发患者中,TSC2、TNFAIP3、IGF1R、WT1出现率最高。其中,Notch2基因突变只发生于移植后复发时,初诊时并未发现,且4例患者中有3名为难治复发患者。(3)移植后复发时克隆的演变移植后复发时克隆演变三种模式:(1)移植后复发时的基因突变与初诊时检测的基因突变无一相同,即复发时出现一群新的克隆。(2)移植后复发时,在初诊基因异常的基础上获得了新的基因异常。(3)在移植后复发时缺失了1个或多个基因异常,同时又获得了1个或多个基因异常。3.Notch2在成人AML患者中的表达、意义及其功能的初步探讨(1)AML患者中Notch2基因m RNA的表达水平AML患者中Notch2基因m RNA的表达水平高于正常对照组(P<0.05)及ALL组(P=0.180)。根据FAB分型分组发现,M3患者的Notch2基因m RNA的相对表达量为0.07494,而其他组表达量中位值0.04637(P=0.174)。根据染色体核型分组发现,伴有t(15,17)核型组和伴有11q23/MLL组的Notch2表达量分别为0.07494和0.06200,其他核型组表达量中位值为0.04762(P=0.22)。(2)Notch2 m RNA表达量与预后的关系Kaplan-Meier分析发现,正常核型AML患者中Notch2基因m RNA高表达组(相对表达量≥0.04)的2年DFS高于低表达组(相对表达量<0.04)(2年DFS分别为51%和17%,P=0.047)。而低表达组和高表达组患者的2年OS差异不显著,分别为38%和63%(P=0.528)。在其他中危核型患者中,Notch2基因m RNA表达量与预后无显著关联(P>0.05)。(3)过表达Notch2能使白血病细胞株THP-1的生长和集落形成能力下降,但是沉默该基因的表达,对其生长增殖未造成显著影响。【结论】1.处于缓解期和体能状态较好的r AML患者在allo-HSCT后,能取得更好的预后。对于移植前处于缓解状态的r AML患者,细胞/分子遗传学以及体能状态对移植结果有显著影响。2.AML患者初诊和异基因造血干细胞移植后复发时,推测基因突变类型可能发生了3种演变模式。初诊时多见涉及信号通路及DNA甲基化调控的基因突变,复发时新出现的基因异常却多见于染色质修饰基因和抑癌基因。3.AML患者中均表达Notch2,在正常核型患者中用荧光实时定量检测Notch2基因m RNA表达水平有一定的提示预后的价值。过表达Notch2在一定程度上能抑制白血病细胞株THP-1增殖,而沉默该基因对细胞株生长影响不显著。